JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:04 dk. • July 8th, 2025
Yaşlanmanın çeşitli aşamalarında glial hücreler ve nöronlar içeren kortikal bir organoidin ince bir bölümünü içeren bir slaytla başlayın.
Yaşlanan nöronlar, azalan hücre fonksiyonu ile yaşlanma durumunda, yüksek seviyelerde beta-galaktosidaz içerir.
Bölüm, hücre yapısını stabilize etmek için bir fiksatif ve zarlarını geçirgen hale getirmek için bir geçirgenleştirici ajan ile ön işleme tabi tutulur.
Solüsyon izlerini gidermek için bir tamponla yıkamak üzere slaydı bir boyama kabına yerleştirin.
Slaytı beta-galaktosidaz enzimi için bir substrat içeren bir çözelti ile boyayın ve inkübe edin.
Substrat, beta-galaktosidazın substratı parçaladığı hücrelere girer ve yaşlanan nöronlarda daha fazla biriken mavi renkli bir ürün üretir.
Bölümü tekrar tekrar yıkayın.
Bir antifade mountant ekleyin ve lekeli bölümün bütünlüğünü sağlayarak katılaşmasına izin verin.
Slaytı mikroskop altında gözlemleyin; yoğun mavi renkli bir ürünün bulunduğu alan, organoid içindeki yaşlanan nöronları gösterir.
Organoidleri kriyoseksiyona tabi tuttuktan sonra, slaytları kapaklı bir slayt standlı kaba aktararak fazla montaj solüsyonunu çıkarın ve kesitli organoid dokuyu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, slaytları yeni yapılmış beta-galaktosidaz boyama çözeltisi ile gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Beta-galaktosidaz çözeltisini çıkarmak için lekeli dokuları PBS ile her biri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Şimdi, yıkanmış dokuları bir cam antifade tutucu ile monte edin ve montaj solüsyonunun mikroskop altında görüntülemeden önce oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmasına izin verin.