JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:36 dk. • July 8th, 2025
Biyotin ile konjuge bir molekül olan biyositin ile doldurulmuş bir internöron içeren sabit bir sıçan hipokampal bölümünü ele alalım.
Daha sonra, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek ve nöronları geçirgen hale getirmek için bloke edici proteinler ve iyonik olmayan bir deterjan içeren bir çözelti ekleyin.
İnternöronlar üzerinde spesifik kanabinoid reseptörlerini hedefleyen bir primer antikor ile inkübe edin.
Fazla antikorları çıkarmak için tampon ile yıkayın.
Ardından, streptavidin ile konjuge bir floresan boya ve bir florofor konjuge ikincil antikor ekleyin.
İnkübasyon sırasında, streptavidin biyositine güçlü bir şekilde bağlanır ve biyositin dolu internöronun görselleştirilmesine izin verirken, ikincil antikor, internöronlar üzerindeki reseptöre bağlı primer antikorları hedefler.
Tampon ile durulayın, bağlanmamış molekülleri çıkarın.
Şimdi, sulu montaj ortamı kullanarak bölümü monte edin. Bir lamel yerleştirin ve kapatın.
Bir floresan mikroskobu kullanarak, biyositin dolu internöron ve kanabinoid reseptör ekspresyonunu görselleştirerek internöronun morfolojisinin ve reseptör dağılımının analizini mümkün kılın
.Dokuları oda sıcaklığında bir saat boyunca% 10 bloke edici serum ile kilitleyin. Daha sonra, kanabinoid reseptörü tip bir ekspresyonunu tanımlamak için primer antikor CB1R'deki bölümleri gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, beyin bölümlerini 0.1 molar PBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Streptavidin ve birinci birincil antikorun ikincil antikoru, her ikisi de kuyu plakasına eklenir ve gece boyunca dört santigrat derecede tutulur.
Daha sonra, biyositini ortaya çıkarmak için streptavidin kırmızı boya konjugatındaki bölümleri karanlıkta gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, beyin bölümlerini her biri 0.1 molar PBS'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Floresansı korumak ve gelecekte yeniden boyanmayı kolaylaştırmak için, bölümleri su bazlı bir montaj ortamına monte edin ve lamellerin kenarlarını şeffaf oje ile kapatın.