İnsan Rektal Aspirasyon Biyopsi Kesitlerinde S-100 Proteininin İmmünohistokimyasal Boyanması

Maruz kalan protein antijenleri ve inaktive edilmiş endojen peroksidazlar ile sabit insan rektal aspirasyon biyopsi kesitleri alın.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir engelleme solüsyonu ekleyin.

Bloke edici solüsyonu, Hirschsprung hastalığının bir belirteci olan hedef glial hücre proteini S-100'e bağlanan birincil antikorlarla değiştirin.

Bağlanmamış antikorları çıkarın ve sinyali yükseltmek için peroksidaz polimerleri ile inkübe edin.

Fazla polimeri çıkarmak için yıkayın. Enzim polimerlerine ve birincil antikorlara bağlanan ikincil antikorlar ekleyin.

Bağlanmamış antikorları çıkarın ve kromojenik bir substrat ekleyin.

Peroksidazlar substrat ile reaksiyona girerek renkli bir çökelti oluşturur.

Fazla çökeltiyi gidermek için durulayın.

Çekirdekleri boyamak için bir boya ekleyin.

Fazla boyayı çıkarmak için bir asit-etanol çözeltisi ile yıkayın.

Daha sonra, artan konsantrasyonlarda etanol ve ardından ksilen kullanarak bölümleri kurutun.

Son olarak, hedef proteinin varlığını gösteren lekelenmeyi görselleştirmek için monte edin ve mikroskop altında gözlemleyin.

Fazla sığır serum albüminini atın ve hücreleri gece boyunca 4 santigrat derecede ilgilenilen birincil antikorun 50 mikrolitresi ile etiketleyin. Ertesi sabah, slaytları PBS'de üç dakikalık üç yıkama ile durulayın ve her slayta 50 mikrolitre polimer arttırıcı ekleyin. 37 santigrat derecede 20 dakika sonra, slaytları PBS'de üç kez yıkayın ve her doku bölümüne 50 mikrolitre ikincil antikor B ekleyin.

37 santigrat derecede 30 dakika sonra, bölümleri PBS'de beş dakikalık üç yıkama ile durulayın ve her slayta bir damla taze hazırlanmış DAB çalışma solüsyonu ekleyin. Işık mikroskobu ile uygun kahverengi lekelenme seviyesi tespit edildiğinde, slaytları PBS'de beş dakika durulayın ve çekirdekleri bir dakika boyunca bir damla hematoksilen ile boyayın.

Fazla lekeyi yaklaşık 30 ila 40 saniye boyunca bir damla su altında çıkarın, ardından taze PBS'de 25 ila 30 saniyelik bir yıkama yapın. Dokuları 10 saniye boyunca% 1 hidroklorik asit etanol içinde ayırt edin, ardından bir dakikalık bir PBS yıkaması yapın.

Slaytları, hidrasyon sırasının tersine beş dakikalık daldırmalarla kurutun ve slaytları beş dakikalık iki ksilen değişimine maruz bırakın. Ardından, ultraclean montaj kullanarak lamel monte edin ve slaytların ışık mikroskobu üzerinde görselleştirilmeden önce kurumasını bekleyin.