Bir Drosophila larvasında yüksek güçlü bir lazer kullanarak hedeflenen nöronal hasarın indüklenmesi

Anestezi uygulanmış bir Drosophila larvasını, vakumlu yağ lekeleri içeren bir cam slayt üzerindeki bir yağ damlasının üzerine başı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Bir lamel yerleştirin ve larva ile temas etmek için hafifçe bastırın.

Larvaları, floresan proteinleri ifade eden hedef nöronları içeren bölgeyi ortaya çıkaracak şekilde ayarlayın.

Slaytı iki fotonlu bir mikroskoba sabitleyin.

Hasarı en aza indirmek için düşük güçlü bir lazer kullanın ve floresan hedef nöronların bulunduğu bölgeyi bulmak için larvaları tarayın.

Ardından, bir tür nöronal projeksiyon olan aksonları içeren hedef bölgeye odaklanmak için tarama penceresini ayarlayın.

Şimdi, tarama hızını azaltın ve lazer gücünü artırın.

Yüksek güçlü lazer, hedeflenen aksonlara çarpacak, onlara zarar veren ve yaralanma bölgesi etrafındaki floresansı artıran lokalize ısı üretecektir.

Son olarak, düşük güçlü lazer moduna geri dönün. Yaralanma bölgesinde küçük krater, halka benzeri yapıların varlığı, başarılı nöronal hasarı doğrular.

Larvaları uyuşturarak başlayın. Çeker ocakta, 60 milimetrelik bir cam tabağı 15 santimetrelik plastik bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, bir parça kağıt mendil katlayın ve cam tabağa koyun. Dietil eter eklendikten sonra üzüm agar plakasını doku üzerine yerleştirin. Ardından, bir cam slayt üzerine, ortasına bir damla halokarbon 27 yağı koyun ve dört köşenin her birine bir nokta vakumlu gres yerleştirin.

Ardından, bir larvayı agar plakasına aktarmak için forseps kullanın ve larvaları uyuşturmak için cam tabağı kapatın. Larva hareket etmeyi bırakır bırakmaz, başı dik olacak şekilde dikkatlice halokarbon yağına aktarın. Ardından, sürgünün üzerine bir lamel yerleştirin ve larvaya değene kadar hafifçe bastırın. Daha sonra, iki foton lazerin onlara en kolay çarpacağı yere ablasyon yapılacak hücreleri yuvarlamak için lamel kaydırmak için hafif bir kuvvet kullanın. Konum, hangi nöronların hedeflendiğine bağlı olarak değişecektir.

Şimdi, düzeneği iki foton mikroskobu aşamasına sabitleyin ve 40x yağa daldırma objektifi kullanarak ilgilenilen hücrelere odaklanın. Yazılımda, tarama moduna geçin ve kaydedilen protokolü yükleyin. İğne deliğinin tamamen açık olduğundan emin olun. Ardından, Canlı modda, ilgilenilen bölgenin iyi bir görüntüsünü elde edin. Ardından, Kırp düğmesinin kullanılabilir hale gelmesi için Canlı taramayı durdurun. Kırpma işlevini kullanarak, hedef alanı yalnızca olası yaralanma bölgesine odaklamak için tarama penceresini ayarlayın.

Ardından yeni bir görüntüleme penceresi açın. Şimdi, tarama hızını azaltın ve lazer yoğunluğunu artırın. Ardından, taramayı başlatmak ve durdurmak için sürekli düğmesini değiştirin. Dikkatlice izleyin. Floresanda ciddi bir artış olur olmaz, taramayı sonlandırın. Ardından, orijinal görüntüleme penceresine geri dönün ve Canlı modunu seçin ve odağı ayarlayarak az önce hedeflenen bölgeyi bulun.

Başarılı bir yaralanmanın iyi bir göstergesi, yaralanma bölgesinde küçük bir kraterin, halka benzeri yapının veya lokalize döküntülerin ortaya çıkmasıdır. Lazer gücü çok yüksek olsaydı, ölümcül olabilecek büyük bir hasar alanı görünürdü.