JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:59 dk. • July 8th, 2025
Bir büyüme ortamında genetik olarak değiştirilmiş insan hücreleri ile başlayın.
Bu hücreler, amiloid öncü proteinine veya APP genine ve bir lusiferaz genine sahip tetrasiklin ile indüklenebilir bir sistem içerir.
Tetrasiklin içeren bir ortamla değiştirin ve inkübe edin.
Tetrasiklin, APP promotörüne bağlanan aktivatör proteine bağlanır.
Bu, gen ekspresyonunu indükler ve hücre zarına lokalize olan öncü proteinleri üretir.
β-Sekretaz enzimi, hücre zarına bağlı kalan bir parça oluşturarak APP'yi parçalar.
γ-sekretaz bu parçayı böler, amiloid β peptitler üretir ve bir aktivatör bileşeni serbest bırakır.
Bu aktivatör çekirdeğe girer, lusiferaz promotörüne bağlanır, gen ekspresyonunu indükler ve lusiferaz enzimleri üretir.
Ortamı, lusiferaz substratını içeren bir tahlil reaktifi ile değiştirin. Substrat hücrelere yayılır ve lusiferaz ile reaksiyona girerek biyolüminesans üretir.
Nöropatolojik durumlarda çok önemli bir enzim olan γ-sekretaz aktivitesini doğrudan yansıtan ışık yoğunluğunu ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.
Bir hemositometre ile NG veya CG hücrelerini sayın. Daha sonra, hücreleri, büyüme ortamında kuyu başına 200 mikrolitrelik bir son hacimde 96 oyuklu mikroplakalara oyuk başına 20.000 hücrede tohumlayın. Mikroplakaları nemlendirilmiş bir karbondioksit inkübatörüne aktarın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Gece boyunca inkübasyonun ardından, her oyuktan 100 mikrolitre büyüme ortamını çıkarın.
% 0.2 dimetilsülfoksit, iki mikromolar CL 387, 785, iki mikromolar DAPT veya diğer ilgili ErbB1 / ErbB2 inhibitörleri ile mililitre başına 2 mikrogram tetrasiklin içeren büyüme ortamı kuyusu başına 100 mikrolitre ekleyin. İşlem görmüş hücreleri mikroplakalarda 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, mikroplakalardan büyüme ortamının oyuğu başına 150 mikrolitre çıkarın.
Daha sonra lusiferaz tahlil reaktifi kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, mikroplakaları bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna aktarın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında tutun. Lüminesans mikroplaka okuyucusunda saklanan önceden tanımlanmış bir programı kullanarak ateşböceği lusiferaz yayılan lüminesansı belirleyin.