İn Vivo Çalışmalar için Medial Ganglionik Eminence Hücrelerinin Viral Aracılı Etiketlenmesi ve Transplantasyonu

Genetik olarak değiştirilmiş fare embriyolarından kortikal internöron progenitörleri içeren medial ganglionik eminence dokusunu hasat edin.

Katyonik bir polimer ekleyin ve dokuyu tek hücreli bir süspansiyona ayırın.

Lox bölgeleri ile çevrili Cre rekombinaz bağımlı bir GFP raportörü taşıyan lentiviral vektörler ekleyin. Kuluçkaya yatmak.

Polimer, viral ve konak hücre zarı yüklerini nötralize ederek viral füzyon ve RNA salınımını sağlar.

Viral RNA ters kopyalanır ve konakçı genomuna entegre edilir.

Süpernatanı santrifüjleyin ve atın. Fazla medyayı emdirin.

Hücreleri hidrofobik bir yüzeye aktarın ve bir enjeksiyon cihazına yükleyin.

Hücreleri anestezi uygulanmış bir fare yavrusunun korteksine enjekte edin.

Yavrunun iyileşmesine ve büyümesine izin verin.

Nakledilen progenitörler, kortekste olgun internöronlara farklılaşır.

Bu internöronların bir alt grubu, Cre rekombinaz ve RFP'yi birlikte eksprese eder.

Bu internöronlarda, Cre lox bölgelerini eksize eder, GFP genini çevirir ve ekspresyonunu sağlar.

Cre eksprese eden internöronları tanımlamak için RFP ve GFP ortak ekspresyonunu görselleştirin.

Lentivirüs hazırlandıktan ve MGE'yi yazılı protokoldeki talimatlara göre diseke ettikten sonra, MGE'nin her iki yarım küresini toplayın ve dokuyu %10 FBS ile 500 mikrolitre DMEM içeren iki adet 1.5 mililitrelik toplama tüpüne koyun.

Tüm dokular toplanana kadar numuneleri buz üzerinde tutun. Ardından tüpleri BSL-2 sertifikalı bir davlumbaza aktarın. Tüpün dibine yerleşmiş MGE dokularını rahatsız etmeden ortamı dikkatlice aspire edin.

Ardından, %10 FBS ortamı ile yaklaşık 500 mikrolitre önceden ısıtılmış DMEM ekleyin. Mililitre başına 8 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona polibren ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar bir P1000 pipet ucundan titre edin. Daha sonra, her tüpe 15 ila 20 mikrolitre konsantre lentivirüs ekleyin.

Ardından, her bir tüpü güvenli bir şekilde kapatın, karıştırmak için ters çevirin ve ardından tüm tüpleri 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Hücreleri lentivirüs ile en az 30 dakika inkübe edin, ancak bir saatten daha uzun süre inkübe edin, çünkü daha uzun süreler hücre canlılığının azalmasına neden olmuştur. Tüpleri her 10 dakikada bir ters çevirin.

İnkübasyonun ardından, tüpleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri peletlemek için üç dakika boyunca 4 santigrat derecede 700 kez g santrifüjleyin. BSL-2 davlumbazında, süpernatanı çıkarın ve% 10 ağartıcıya atın. Daha sonra,% 10 FBS ile 1 mililitre DMEM ekleyin ve peleti yıkamak için iki ila üç kez titre edin.

Daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, fazla virüsü gidermek için bu yıkama adımını iki ila üç kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, mümkün olduğu kadar çok ortamı çıkarın ve her tüpü buzun üzerine koyun.

Tüpün yanlarındaki artık ortam nedeniyle, transplantasyon prosedürü başladığında yaklaşık 2 ila 3 mikrolitre ortam hücre peletini kaplayacaktır. Steril tekniğin baştan sona kullanıldığından emin olurken, mineral yağı 1 mililitrelik bir şırıngaya çekin ve ardından 30.5 gauge iğne ile cam pipeti tamamen mineral yağ ile doldurun.

Ardından, cam pipeti stereotaksik cihaza takın ve pistona yükleyin. Hidrolik tahriki kullanan bir asistanla, pistonu cam pipetin yaklaşık yarısına kadar hareket ettirin ve dökülen mineral yağı temiz bir kağıt havluyla temizleyin.

Ardından, steril bir kağıt havlunun köşesini ince bir noktaya çevirin ve bunu MGE hücre peletinin üzerindeki fazla ortamı hassas bir şekilde çıkarmak için kullanın. Bu, hücre yoğunluğunu yoğunlaştıracak ve böylece daha küçük enjeksiyon hacimleri elde edilebilecektir.

Ardından, hücre peletini yavaşça çekmek için bir P2 pipeti kullanın ve hidrofobik bir yüzeye dağıtmadan önce bir ila iki kez titre edin. Hacim 1 mikrolitrenin hemen altında olmalıdır.

İğnenin ucunu hücre süspansiyonuna hareket ettirin ve hidrolik tahriki kullanarak hücre süspansiyonunu pipete çekin. Bir yavruyu hipotermi yoluyla uyuşturduktan sonra, cildi forseps ile ayak parmakları arasında sıkıştırarak anestezinin etkinliğini kontrol edin. Herhangi bir reaksiyon görülmemelidir.

Daha sonra, yavruyu enjeksiyon cihazının altındaki bir kalıba yerleştirin ve cildi kafanın üzerine geri çekerek ve ardından standart laboratuvar bandı ile sabitleyerek cildi gergin hale getirin. Hızlı bir şekilde çalışarak, cam pipetin ucunu yavrunun kafasına, başın yüzeyine dik olarak yerleştirmek için stereotaksik kolu manipüle edin.

Pipet kafa ile temas ettiğinde, bunu sıfır olarak kabul edin. Ardından, pipeti cildin ve kafatasının yüzeyinden kortekse doğru itin. Ardından, durmadan önce pipeti iki kez yerleştirin ve geri çekin.

Hücrelerin neokortekse hedeflenmesi için, mikropipet 0.1 milimetre derinlikte olduğunda enjeksiyonlar yapılır. İğne yerine oturduktan sonra, pistonu cam pipete ilerletmek için hidrolik cihazı döndürün ve saha başına 50 ila 70 nanolitre enjekte edin.

Neokorteks boyunca dönüştürülmüş hücrelerin geniş bir dağılımı gerekiyorsa, bu işlemi farklı rostral-kaudal seviyelerde üç ila altı farklı bölgede tekrarlayın. Enjeksiyonlar tamamlandığında, yavruyu sahneden çıkarın ve onaylanmış prosedürlere göre işaretleyin.

Yavru iyileştiğinde ve kendi başına hareket edebildiğinde, emziren dişi ve çöpün geri kalanıyla birlikte geri koyun. Sağlıkta herhangi bir bozulma belirtisi olmadığından emin olmak için işlemden sonra ve ertesi gün yavruları kontrol edin.