Dorsal Kök Ganglion Duyusal Nöronlarının Bir Nöropeptit Reseptör Agonisti Kullanılarak Uyarılması

Transfekte sıçan dorsal kök ganglion duyusal nöronları içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Test kuyusu nöronları azalmış nöropeptit reseptör ekspresyonu sergilerken, kontrol kuyusu nöronları fizyolojik seviyelerde nöropeptit reseptör ekspresyonu sergiler.

Doğru stimülasyon yanıtı için kontrollü bir ortam sağlamak üzere ortamı serumsuz ortamla değiştirin.

Kuyucuklara bir nöropeptit reseptör agonisti ekleyin ve karıştırın. Plakayı inkübe edin.

Kontrol kuyusunda, nöropeptit reseptör agonisti hedef reseptörlere bağlanarak nörotransmiterleri serbest bırakan hücre içi bir sinyal kaskadını tetikler.

Bununla birlikte, test kuyucuklarında, azalmış nöropeptit reseptör ekspresyonu, agonist bağlanmasını sınırlar ve kontrole kıyasla nörotransmitter salınımının azalmasına neden olur.

Kuluçkadan sonra, ortamı kuyulardan ve santrifüjden toplayın.

Süpernatanı tüplere aktarın ve nörotransmitter seviyelerini ölçmek için uygun bir immünolojik test kullanın. Kontrol numunesi, nöroreseptör agonist stimülasyonunu takiben test numunesinden daha yüksek nörotransmitter salınımı sergiler.

6. günde, kaplamadan sonra ve siRNA transfeksiyonundan 72 saat sonra, kültür ortamını 200 mikrolitre serumsuz ortama değiştirin. 30 dakikalık bir inkübasyonun ardından, 1 mikrolitre stimülasyon kimyasalı ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. Gerekli süre boyunca inkübe edildikten sonra, kültür ortamını kültür kabından toplayın ve askıda kalan safsızlıkları gidermek için 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı santrifüjden toplayın ve gerektiği kadar fosfat tamponlu tuzlu su ile seyreltin.