Transendotelyal Elektrik Direncinin İn Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modelinde Değerlendirilmesi

İn vitro kan-beyin bariyerine benzeyen fare beyni mikrovasküler endotel hücrelerini içeren bir zar eki ile başlayın.

Bu parçayı, gömülü bir elektrot içeren bir transendotelyal elektrik direncine veya TEER cihazına yerleştirin.

Alt bölmeye yeni ortam ekleyin.

Elektrotlu kapağı TEER kuyularının üzerine yerleştirin, ardından cihazı bir inkübatöre koyun ve bir kayıt sistemine bağlayın.

Elektrotlar, transendotelyal direncin ölçümü için hücre tabakası boyunca bir elektrik akımı üretir.

Hücreler arasındaki sağlam bağlantı proteinleri, akımın akışını engelleyerek daha yüksek bir TEER değerine neden olur.

Cihazın bağlantısını kesin ve çıkarın.

Kapağı sökün, üst bölmeden bir miktar ortam çıkarın ve önceden etkinleştirilmiş T hücreleri ekleyin. TEER ölçümü için cihazı yeniden monte edin.

Aktive edilmiş T hücreleri, endotel hücreleri ile etkileşime girerek enflamatuar faktörleri ve sitolitik enzimleri serbest bırakarak bağlantı bütünlüğünü bozar.

Bu bozulma elektrik akımı akışını artırarak daha düşük bir TEER değeri ile sonuçlanır.

TEER ölçümünü ayarlamak için, TEER cihazının 24 oyuklu modülünü laminer akış başlığına yerleştirin. Kapakları çıkarın ve MBMEC'li ekleri forseps kullanarak cihaza yerleştirin.

Daha sonra, 810 mikrolitre taze ortamı modül kuyularının alt bölmesine pipetleyin. Ek parça ile modülün duvarı arasına dikkatlice yerleştirin. Bundan sonra, kapakları kapatın ve cihazı inkübatöre yerleştirin. Enstrümanı bilgisayara bağlayın. Ardından, cihaz denetleyicisini açın ve yazılımı açın.

Açılan pencerede 'Yeni ölçüm'ü seçin. 'TEER'i Göster' ve 'Ccl'yi Göster' kutularını işaretleyin, ardından 'Başlat'a basın. İlk ölçümü tamamladıktan sonra, tüm TEER ve Ccl değerlerini görmek için 'sonuçlar' sekmesinde 'Tüm kuyucukları kontrol et'i seçin. Ardından dosyayı kaydedin.

Ardından, Ccl stabil olduğunda ve santimetre kare başına 1 mikrofaraddan daha düşük olduğunda ve TEER maksimum seviyesine ulaştığında MBMEC'leri T hücreleri ile birlikte kültürlemek için zaman noktasını seçin. Mutlak TEER ve Ccl değerlerini dikkatlice inceleyin ve bu tür kuyuların işaretini kaldırarak MBMEC'lerin yeterince birleşik tek tabaka geliştirmediği kuyuları hariç tutun.

Kuyucuklara sağ tıklayarak ve 'Yeni ortalama kuyuya kuyu ekle' seçeneğini seçerek kuyuların geri kalanını gruplandırın. Açılır pencerede adlandırın ve gruplandırılacak tüm bireysel kuyular için aynısını yapın. Ardından, hepsinin ko-kültürden önce aynı başlangıç koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyuları kontrol edin.

'Deney' sekmesinde, 'Duraklat'a basın. Aleti kesin ve inkübatörden çıkarın. Ardından, laminer akış başlığındaki kapakları çıkarın. Daha sonra, ortamın bir kısmını üst kuyu bölmesindeki Ek'ten çıkarın. 150 mikrolitre ortamı dikkatlice pipetleyerek MBMEC'lere T hücreleri ekleyin. Ardından, cihazı yeniden bağlayın ve 'Ölçüme devam et' düğmesine basın. 24 saat sonra, 'Deney' sekmesindeki 'Durdur'a basın ve dosyayı kaydedin.