JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:58 dk. • July 8th, 2025
Kolin asetiltransferaz enzimini ifade eden sinir lifleri açısından zengin, Meynert'in çekirdek bazalini içeren sabit bir fare beyni bölümünü ele alalım.
Kesit, endojen peroksidazı devre dışı bırakmak için ön işleme tabi tutulur.
Hücresel zarları geçirgen hale getirmek için bir deterjan ekleyin, ardından spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir bloke edici çözelti ekleyin.
Çözeltiyi, kolin asetiltransferaza bağlanan birincil antikorlarla değiştirin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın. Primer antikorlara bağlanan biotin etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarın ve ikincil antikorlara bağlanan avidin-biotin-peroksidaz kompleksleri ekleyin.
Fazla kompleksleri çıkarmak için yıkayın.
Peroksidaz ile reaksiyona giren ve renkli bir çökelti oluşturan kromojenik bir substrat ekleyin.
Fazla çökeltiyi gidermek için damıtılmış su ile durulayın.
Bölümü jelatinleştirilmiş bir slayt üzerine aktarın.
Daha sonra, artan etanol konsantrasyonları ve ardından ksilen kullanarak bölümü kurutun.
Kesiti monte edin ve lekeli sinir liflerini görselleştirmek için mikroskop altında gözlemleyin.
Doku bölümlerinin immünohistokimyasal olarak işaretlenmesi için, tris-tamponlu salin içinde% 0.1 Triton X-100 içinde% 10 normal sığır serumu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı bloke ettikten sonra, bölümleri dört santigrat derecede 48 saat boyunca ilgilenilen birincil antikor ile etiketleyin.
Kuluçka süresinin sonunda, bölümleri yıkama başına taze tris-tamponlu tuzlu su ile üç dakika boyunca üç kez yıkayın. Ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir biyotinile edilmiş ikincil antikor ile inkübasyon yapılır.
İnkübasyonun sonunda, bölümleri gösterildiği gibi taze tris-tamponlu tuzlu su içinde üç kez yıkayın. Ardından üreticinin protokollerine göre avidin-biotin-peroksidaz kompleksi ve DAB peroksidaz substrat çözeltisi ile boyama yapılır.
Yıkadıktan sonra, bir beyin dokusu örneğindeki tüm bölümleri jelatinleştirilmiş bir lam üzerine monte edin. Numunelerin kurumasına izin verin. Bölümleri kurutmak için, numuneleri seyreltme başına beş dakika boyunca iki kez, belirtildiği gibi sıralı artan etanol çözeltilerine daldırın, ardından iki adet 10 dakikalık ksilen yıkama ile temizleyin. Ardından, lamellerin kızakların üzerine yerleştirmek için uygun bir montaj ortamı kullanın.