Radyo İşaretli Dopamin Kullanarak Fare Beyin Sinaptozomlarında Dopamin Alımının Ölçülmesi

Bir fare beyninden dopamin taşıyıcıları (DAT) içeren nöronal sinapsların sağlam presinaptik terminallerinden türetilen zara bağlı yapılar olan sinaptozomları hasat edin.

Test tüplerini ligandlar içeren tamponlarla ve referans tüplerini ligandlar ve bir DAT inhibitörü içeren tamponla doldurun.

Sinaptozomları ekleyin.

Ligandlar, dopamin parçalayıcı enzimleri ve diğer taşıyıcıları inhibe ederek dopamin bozulmasını ve spesifik olmayan alımı önler.

Etiketlenmemiş ve radyoaktif işaretli dopamini tanıtın.

Test durumunda, sinaptozomal DAT dopamini alır.

Referans durumunda, inhibitör DAT aracılı dopamin alımını önler ve sadece arka plan alımına izin verir.

Numuneleri, sinaptozomları tutan mikrofiber filtrelere ekleyin.

Bağlanmamış dopamini çıkarmak için yıkayın.

Filtreleri sintilasyon tüplerine aktarın.

Radyosensitif bir bileşik içeren sintilasyon sıvısı ekleyin.

Tüpleri bir parıldama sayacına yerleştirin.

Dopaminden gelen radyoaktif emisyonlar, bileşiği, sayaç tarafından ölçülen ışığı yaymak için uyarır.

Sinaptozomal dopamin alımını ölçmek için referansı test verilerinden çıkarın.

Bu adımda, belirlenmiş 12 adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 440 mikrolitre alım tamponu, ligand ve kokain ve kalan 36 adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 440 mikrolitre alım tamponu ve ligand ekleyin. 6 adet 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünü 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 ve 0.31 olarak etiketleyin. Daha sonra en düşük sayıya sahip 5 mikrosantrifüj tüpüne 750 mikrolitre alım tamponu ve ligand ekleyin.

Daha sonra, 10 etiketli tüpe 1.455.4 mikrolitre alım tamponu ve ligand, 14.6 mikrolitre etiketlenmemiş dopamin ve 30 mikrolitre tritiye dopamin ekleyin. Daha sonra, karışımın 750 mikrolitresini 10 etiketli tüpten 5 etiketli tüpe aktarın. İyice karıştırın ve karışımın 750 mikrolitresini bu tüpten 2.5 etiketli tüpe aktarın. Bu seyreltmeyi kalan tüplerle tekrarlayın.

Bundan sonra, cam mikrofiber filtreleri 12 oyuklu bir filtre kovasına yerleştirdikten sonra 4 mililitre alım tamponu ile önceden durulayın. Bunu takiben, 440 mikrolitre tampon içeren ilk 24 adet 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre sinaptozomal membran süspansiyonu ekleyin. Dikkatlice girdap yapın ve sinaptozomların tampona daldırıldığından emin olmak için kısa bir süre aşağı doğru döndürün.

Ardından, 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakın. 10 dakika sonra, ilk 2 sütuna 10 mikromolar ve 5 mikromolar 50 mikrolitre dopamin ekleyin ve çalkalayarak 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakın. 5 dakika sonra, 1 mililitre buz gibi soğuk alım tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun. 2.5 mikromolar ve 1.25 mikromolar ile ve ardından 0.62 mikromolar ve 0.31 mikromolar ile tekrarlayın.

Numuneleri önceden durulanmış mikrofiber filtrelere ekleyin ve 5 x 4 mililitre buz gibi soğuk alım tamponu ile yıkayın. Filtrelere ilk 12 numune eklendikten sonra, filtreleri sintilasyon tüplerine taşıyın. Bunu sonraki 12 örnekle tekrarlayın. 49 ila 51 arasındaki sintilasyon tüplerinin altına bir mikrofiber filtre yerleştirerek ve üstüne 25 mikrolitre maksimum 10 mikromolar dopamin ekleyerek 3 maksimum sayma tüpü hazırlayın.

Bunu takiben, 51 sintilasyon tüpünün tamamını 1 saat boyunca çeker ocakta bırakın. Ardından, her bir sintilasyon tüpüne 3 mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin ve 1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde kuvvetlice çalkalayın. Bir beta sayacında 1 dakika boyunca tritine dopamini saymak için programı açın ve uygun ayarları seçin. Protein tayini için, ayarlamalar için sinaptozomların protein konsantrasyonlarını belirlemek ve numuneler arasındaki alımın uygun şekilde karşılaştırılması için standart bir BCA protein tahlil kiti kullanın.