Görselleştirme için sıçan hipokampal dilimlerinde biyositin dolu internöronların etiketlenmesi

İnaktive edilmiş endojen peroksidazlar ile biyositin dolu internöronlar içeren sabit ve geçirgen sıçan hipokampal dilimleri alın.

Yaban turpu peroksidaz (HRP) içeren avidin-biyotin kompleksleri (ABC) ekleyin ve inkübe edin, avidinin biyositine bağlanmasına izin verin.

Bağlanmamış ABC'yi yıkayın.

Kromojenik substrat ve metal arttırıcı karışımı ekleyin, ardından inkübe edin.

Güçlendirici kontrastı iyileştirirken, substratı koyu bir çökelti oluşturmak üzere oksitleyen HRP'yi aktive etmek için hidrojen peroksit ekleyin.

Dilimleri filtre kağıdına aktarın ve fazla tamponu çıkarın. Kontrastı artırmak için osmiyum tetroksit ile tedavi edin.

Dilimleri bir sürgün üzerine yerleştirin ve monte edin. Artan etanol konsantrasyonları kullanarak bunları kurutun.

Dilimleri mutlak etanol ve propilen oksit ile yıkayın.

Dokulara sızmak için reçine ekleyin.

Dilimleri bir planşete yerleştirin ve reçineyi polimerize etmek için ısıtın. Dilimleri bir slayta aktarın, bir lamel yerleştirin ve reçineyi katılaştırın.

Işık mikroskobu kullanarak, koyu lekeli biyositin dolu internöronları görselleştirin.

Bölümleri PBS içeren temiz bir cam şişeye yerleştirin. HRP reaksiyon ürününü amplifiye etmek için önce bölümleri avidin biotin kompleksi veya ABC içinde en az iki saat inkübe ederek avidin HRP reaksiyonunu gerçekleştirin.

Daha sonra, bölümleri PBS ile 3 kez 10 dakika boyunca yıkayın ve ardından Tris tamponu ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Son eser tampon yıkamayı çıkardıktan sonra, diaminobenzidin çözeltisine veya DAB çözeltisine hızlı bir şekilde 1 damla% 8 nikel klorür çözeltisi ekleyin. Ardından karıştırmak için çözeltiyi içine ve dışına pipetleyin.

Ve hızlı bir şekilde bu çözeltiden 1 mililitre bölümlerin üzerine ekleyin. Bu çözeltideki bölümleri 15 dakika inkübe edin. Ardından, DAB çözeltisine 10 mikrolitre% 1 hidrojen peroksit ekleyin. Reaksiyonun, hücreler etiketlenene kadar yaklaşık 1 ila 2 dakika boyunca sürekli çalkalama altında karanlıkta ilerlemesine izin verin.

Bir çeker ocakta, bir Petri kabına küçük bir daire filtre kağıdı yerleştirin ve PB ile nemlendirin. Bölümleri bir boya fırçası kullanarak cam şişeden birer birer kaldırın ve dikkatlice kağıdın üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Bölümleri başka bir nemli filtre kağıdı çemberi ile örtün. Ve kağıt mendili yüzeye hafifçe dokundurarak fazla tamponu çıkarın.

Üst kağıda PB'de 8 veya 9 damla %1 osmiyum tetroksit uygulayın. Çanağın üzerini örtün ve çeker ocakta en az 30 dakika, ancak bir saatten fazla olmamak üzere tutun. Bölümleri duruladıktan, monte ettikten ve kapağı kaydırdıktan sonra, %50, %70, %95 ve %100 alkol solüsyonlarından oluşan bir seriyle kurutun.

Dehidrasyon adımını takiben, bölümleri yaklaşık 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde% 100 etanol içeren bir cam şişeye aktarın. Alkol solüsyonunu propilen oksit ile değiştirin ve 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, şişede yaklaşık 2 mililitre propilen oksit bulundurun ve bire bir oranında reçine ekleyin.

Reçinenin çözündüğünden emin olun ve bölümleri 30 dakika boyunca sürekli çalkalayın. 30 dakika sonra, her bölümü epoksi reçine içeren bir alüminyum panelchet içine yerleştirmek için tahta bir çubuk kullanın ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, planchet'i yaklaşık 10 dakika sıcak bir tabağa koyun.

Ardından, her bölümü tahta bir çubukla alın ve temiz bir slayt üzerine yerleştirin. Tüm bölümler slayta aktarıldıktan sonra, dilimlerin yönünü kontrol etmek için slaydı diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin ve bölümlerin üzerine bir lamel yerleştirin. Fırında 56 santigrat derecede 48 saat kürleyin.