Sıçan Beyin Bölümlerinde RNA Ekspresyonunu İncelemek için Oligonükleotid Probları Kullanılarak Yerinde Hibridizasyon

Serotonin sendromlu bir sıçandan sabit beyin kesitleri alın, bu da nöronlarda serotonin reseptörü RNA sentezinin değişmesine yol açar.

Alkol kullanarak dokuyu kurutun. Endojen hidrolize edici enzimleri devre dışı bırakmak için bir ön işlem solüsyonu uygulayın ve bunların tespit reaktifleri ile etkileşimlerini önleyin.

Fiksasyonun neden olduğu çapraz bağları kırmak için bir kaynar tampon ile muamele edin ve hedef RNA'ları açığa çıkarın.

Dokuyu kurutun, hidrofobik bir bariyer çizin ve hücresel zarlara nüfuz etmek için bir çözelti ile inkübe edin.

Oligonükleotid probları ekleyin ve inkübe edin, probların hedef RNA'larla hibritleşmesine izin verin.

Bağlanmamış probları çıkarmak için yıkayın, ardından oligonükleotid problarına bağlanan ön yükseltici, amplifikatör ve enzim konjuge etiket probları içeren amplifikasyon reaktifleri ile inkübe edin.

Enzim konjuge problar tarafından hidrolize edilen ve görünür renk üreten kromojenik substratlarla inkübe edin.

Doku şeffaflığını artırmak için ksilen ile muamele edin, bir montaj ortamı ekleyin ve bir lamel uygulayın.

Mikroskop altında, dokudaki renkli noktalar hedef RNA ekspresyonunu ölçmeye yardımcı olur.

Bu prosedürde, dehidrasyon için, negatif 80 santigrat derece dondurucuda saklanan mikroskop slayt kutuları için dört slayt alın. Bölümleri ppiB, dapB ve ht2a genlerinin testlerine atayın. Bunları tükenmez kalemle işaretleyin ve etiketleyin.

Ardından, slaytları oda sıcaklığında% 100 alkole beş dakika batırın. Ardından, slaytları çeker ocakta beş dakika kurutun. Ön işlem için, her bölüme bir reaktif olmak üzere 20 mikrolitre ön işlem pipetleyin.

Slaytları bir nem tepsisindeki bir raf rayına yerleştirin. Nem tepsisini yatay bir çalkalayıcı üzerinde düşük hızda 10 dakika boyunca hafifçe sallayın. Ardından, slaytları iki dakika boyunca çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın. Slaytları, 450 mililitre ön işlem 2 reaktifi içeren 1.000 mililitrelik bir behere batırın.

Daha sonra, RNA yapısını eski haline getirmek için slaytları 100 santigrat derecede toplam beş dakika kaynatın. Bundan sonra, slaytları her seferinde iki dakika boyunca çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın. Slaytları beş dakika boyunca% 100 alkole yerleştirin.

Ardından slaytları çeker ocakta beş dakika kurutun. Doku bölümünde seçilen alanın etrafına bir daire çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Ardından, prob penetrasyonunu artırmak için seçilen her alana 10 mikrolitre ön işlem reaktifi pipetleyin ve nem tepsisini bir kapakla kapatın.

Ardından, tepsiyi yatay bir çalkalayıcı ile donatılmış hibridizasyon fırınına yerleştirin. Fırın sıcaklığını 40 santigrat dereceye ayarlayın ve tepsiyi 30 dakika hafifçe sallayın. Daha sonra, slaytları her seferinde iki dakika boyunca çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın.

Bu adımda, seçilen alanlara 10 mikrolitre ppiB, dapB veya htr2a probu pipetleyin. Ardından, reaktifin buharlaşmasını önlemek için nem tepsisini bir kapakla kapatın. Slaytları 40 santigrat derecede fırında iki saat inkübe ederken yatay çalkalayıcı üzerinde düşük hızda hafifçe sallayın.

Ardından, slaytları her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon 1 reaktifi pipetleyin. Slaytları çalkalayın ve 40 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon 2 reaktifi pipetleyin. Slaytları çalkalayın ve 40 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Bundan sonra, slaytları her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon 3 reaktifi pipetleyin. Slaytları çalkalayın ve 40 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından slaytları iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon 4 reaktifi pipetleyin. Slaytları çalkalayın ve 40 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, slaytları iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon 5 reaktifi pipetleyin. Slaytları oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayın ve inkübe edin. Daha sonra, slaytları iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.

Seçilen her alana 10 mikrolitre amplifikasyon 6 reaktifi pipetleyin. Slaytları çalkalayın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez tekrar yıkayın.

Şimdi, seçilen her alana 10 mikrolitre kırmızı reaktif pipetleyin. Slaytları oda sıcaklığındaki yatay çalkalayıcı üzerindeki nem tepsisine yerleştirin ve 10 dakika boyunca düşük hızda hafifçe çalkalayın. Ardından, slaytları her seferinde 10 dakika boyunca çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın.

Slaytları 60 derecelik fırında 15 dakika kurutun. Bundan sonra, slaytları beş dakika boyunca çeker ocakta ksilen içine yerleştirin. Ardından, seçilen her alana 20 mikrolitre ksilen bazlı montaj ortamı pipetleyin ve bir lamel ile örtün.