JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:38 dk • July 8th, 2025
Farklı sertlikteki hidrojellerle kaplanmış lameller üzerinde büyütülen yapışık nöral krest hücre kültürlerini alın. Hücreleri tampon ile yıkayın.
Hücreleri sabitlemek ve hücresel morfolojiyi korumak için paraformaldehit ekleyin.
Fazla paraformaldehiti gidermek için hücreleri tamponla yıkayın.
Ardından, hücre zarlarına nüfuz etmek için iyonik olmayan bir deterjan ekleyin.
Fazla deterjanı çıkarmak için hücreleri tamponla yıkayın.
Ardından, spesifik olmayan bağlamayı önlemek için bir engelleme çözümü sunun.
Hücreleri, aktin filamentlerine bağlanan yüksek afiniteli filamentli bir aktin probu ile inkübe edin.
Bağlanmamış probları çıkarmak için hücreleri tamponla yıkayın.
Çekirdekleri lekelemek için bir floresan nükleer boya ekleyin, ardından fazla boyayı çıkarmak için tamponla yıkayın.
Lamellere montaj ortamı uygulayın ve lekeli hücreleri bir floresan mikroskobu altında inceleyin.
Daha sert hidrojeller üzerinde yetiştirilen hücreler, daha yumuşak hidrojeller üzerinde yetiştirilenlere göre daha fazla aktin filament oluşumu ve daha yayılmış bir morfoloji gösterir.
Doğrudan plaka üzerinde büyütülen hücrelerden gelen yanlış sinyalleri en aza indirmek için lamelleri yeni bir plakaya taşımak için cımbız kullanın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 500 mikrolitre% 0.1 Triton X-100 ile muamele etmeden önce 10 dakika boyunca 500 mikrolitre% 4 paraformaldehit kullanarak hücreleri sabitleyin.
15 dakika sonra, hücreleri 250 mikrolitre% 10 Eşek serumu ile bloke edin. Hücreleri, 250 mikrolitre% 10 Eşek serumunda 1 ila 400 seyreltmede falloidin ile F-aktin için boyayın, ardından 10 dakika boyunca DAPI ile inkübe edin.
Her bir oyuğa üç ila dört damla montaj ortamı eklemeden önce hücreleri PBS ile iki dakika yıkayın. Bir floresan mikroskobunda, tek tek ve birleştirilmiş kanallar üreten hidrojel numunesi başına en az üç rastgele karenin görüntülerini yakalayın.