JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 4:11 dk. • July 8th, 2025
Kontrolü ve mutant Drosophila larvalarını glikoz içermeyen bir tampon içeren ayrı tabaklara yerleştirin.
Merkezi sinir sistemini veya CNS'yi açığa çıkaran iç organları çıkarmak için larvaları inceleyin.
CNS, motor nöronları barındıran bir ventral sinir kordonu içerir. Mutant larvalarda, bu nöronlar yukarı regüle edilmiş glikoz metabolizması sergiler.
Her iki gruptaki motor nöronlar, donör ve alıcı floroforlar içeren hücre içi glukoz sensörlerini eksprese eder.
Larvaları konfokal bir mikroskop altında konumlandırın. Uyarılma üzerine, donör florofor floresan yayar.
Bu floresanı kullanarak motor nöronları bulun.
Tamponu glikoz takviyeli bir çözelti ile değiştirin.
Glikoz nöronlara girer, sensörlere bağlanır ve iki floroforu yakınlaştıran konformasyonel bir değişikliği tetikler.
Uyarılma üzerine, alıcı, floresan rezonans enerji transferi veya FRET olarak adlandırılan donör tarafından yayılan enerjiyi emer ve floresan yayar.
FRET sinyali, glikoz alımı ile ilişkilidir. Mutant larvalarda kontrole kıyasla daha yüksek bir alıcı sinyal yoğunluğu, yukarı regüle edilmiş glikoz metabolizmasını gösterir.
Diseksiyonlara başlamadan önce görüntüleme mikroskobunu ve lazerleri açın. Ardından, dolaşan üçüncü bir instar larvası toplayın. Çift damıtılmış su ile durulayın ve önceden hazırlanmış elastomer kaplı bir tabakta bir damla HL3 tamponuna koyun.
Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, larvaların ön ve arka uçlarını, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde, larvaları böcek pimleri ile uzunlamasına dikkatlice gererek sabitlemek için bir çift forseps kullanın. Bir çift açılı iris makası kullanarak, arka pimin hemen üzerinde bir kesi yapın. Daha sonra kesiden larvaların ön ucuna doğru dikey bir kesim yapın.
Birkaç damla HL3 tamponu ekledikten sonra, gerekirse, merkezi sinir sistemini rahatsız etmeden trakeayı ve yüzen organların geri kalanını çıkarın. Ardından, nöromüsküler sistemi sağlam tutarken merkezi sinir sistemini ortaya çıkarmak için vücut duvarını gererek kanatları sabitleyin.
Görüntü elde etmek için, 40 kez suya daldırma mercekli dik bir konfokal mikroskop kullanın. Ardından, CFP'yi uyarmak için 405 nanometre lazeri seçin. Ardından, tarama hızı, ortalama, hedef, yakınlaştırma iğne deliği boyutu ve uzamsal çözünürlük gibi alım parametrelerini optimize edin. Kazancı, sinyal optimum dinamik aralıkta olacak şekilde ayarlayın ve tüm genotipler için aynı parametreleri kullanın.
Ventral sinir kordonu içindeki motor nöronları görüntülemek için, diseke edilmiş numunenin bulunduğu silikon kabı lensin altına yerleştirin ve lensi, trehaloz sükroz HL3 ile temas edecek şekilde indirin. Lensin tampon belleğe tamamen daldırıldığından emin olun ve gerekirse daha fazla tampon bellek ekleyin.
Daha sonra, CFP ve FRET kanallarını kullanarak, ventral sinir kordonu orta hattı boyunca yer alan, odakta en az 6 motor nörondan oluşan bir optik seçimi manuel olarak seçin. Ardından, her 10 saniyede veya 10 dakikada bir görüntü alın. Bu görüntüler taban çizgisini temsil eder.
Glikoz stimülasyonu için, bir Pasteur pipeti kullanarak HL3 tamponu içeren trehaloz sükrozu çıkarın ve ventral sinir kordonunu hareket ettirmeden 5 milimolar glikoz takviyeli HL3 tamponu ekleyin. Ardından, 10 dakika daha boyunca her 10 saniyede bir görüntü alın.
Bu görüntüler stimülasyon aşamasını temsil eder. Görüntüleri nokta czi dosyaları olarak veya görüntüleme yazılımı tarafından desteklenen herhangi bir dosya türüyle, tarih, genetik arka plan, deneysel durum ve kullanılan kanallar dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin. Tüm genotipleri görüntülemek için parametreleri yeniden kullandı.