Bir Fare Beyin Dokusu Bölümünde Floresan Etiketli Astrositlerin İmmün Boyanması

Bir floresan proteini ifade eden seyrek bir astrosit popülasyonu içeren sabit bir fare beyin dokusu bölümünü ele alalım.

Hücrelere nüfuz etmek için serbest yüzen bölüme deterjan içeren bir tampon uygulayın.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bölümü bir bloke edici tamponda inkübe edin.

Bölümü birincil antikorlarla tedavi edin ve antikorların astrositlerdeki floresan proteinlere bağlanmasına izin vermek için inkübe edin.

Tampon kullanarak fazla primer antikorları yıkayın.

Daha sonra, bölümü, birincil antikorlara bağlanan florofor etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin.

Bağlanmamış ikincil antikorları bir tampon ile yıkayın.

Deterjan kalıntılarını gidermek için bölümü tampondan deiyonize edilmiş bir su karışımına aktarın.

Bölümü, tampon deiyonize su içeren bir slayt üzerine yerleştirin. Fazla sıvıyı çıkarın ve montaj ortamını ekleyin. Ardından, bir lamel yerleştirin ve sabitleyin.

Son olarak, kesit içindeki etiketli floresan proteini ifade eden astrositleri görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanın.

Başlamak için, 50 mililitrelik bir tüpe 1 mililitre% 10 Triton X ekleyerek ve tüpü TBS ile 50 mililitreye kadar doldurarak taze bir TBST çözeltisi hazırlayın. Keçi serumu ve TBST'yi 15 mililitrelik bir tüpte birleştirerek her beyin için 2 mililitre bloke edici ve antikor solüsyonu hazırlayın.

Ardından, farklı numuneleri farklı sıralara, farklı çözeltilere, farklı sütunlara yerleştirmek için 24 oyuklu bir plakayı etiketleyin. Ardından, 'Yıkama 1', 'Yıkama 2' ve 'Yıkama 3' olarak etiketlenmiş ilk üç sütuna 1 mililitre TBST ekleyin ve dördüncü sütuna 1 mililitre bloke edici solüsyon ekleyin.

5.75 inçlik bir Pasteur pipetinin ucunu bir Bunsen brülörü kullanarak küçük bir kanca halinde eriterek bir cam kazma hazırlayın. Daha sonra 12 oyuklu plakadan doku kesitlerini, kazmayı kullanarak 24 oyuklu plakanın 'Yıkama 1' sütununa aktarın. Daha sonra, bölümleri bir kuyudan diğerine aktarmak için cam kazmayı kullanarak Yıkama 1, 2 ve 3 kuyucuklarında her biri 10 dakika boyunca yıkayın, ardından bölümleri bloke etme solüsyonunda bir saat inkübe edin.

Daha sonra, birincil antikordaki bölümleri çalkalama sırasında 4 santigrat derecede iki ila üç gece inkübe edin. Primer antikor inkübasyonundan sonra, yıkama kuyucuklarından bir gün TBST'yi aspire edin. Daha sonra her yıkama kuyusuna 1 mililitre yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın.

Daha sonra, ikincil antikordaki bölümleri oda sıcaklığında üç saat inkübe edin. İkincil antikor inkübasyonundan sonra, yıkama kuyucuklarından iki gün TBST'yi aspire edin. Daha sonra her yıkama kuyusuna 1 mililitre yeni TBST ekleyin ve bölümleri ilk yıkama kuyusuna taşıyın.

Son yıkama sırasında, montaj ortamını 4 santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmasını bekleyin. Daha sonra deiyonize suda 2'ye 1 TBS karışımı hazırlayın ve bir Petri kabına ekleyin. Daha sonra, yüzeye deiyonize su içinde 800 mikrolitre 2 ila 1 TBS karışımı ekleyerek bir mikroskop lamı hazırlayın.

'Wash 3' kuyusundan bölümleri Petri kabına aktarın. Ardından, ince bir boya fırçası kullanarak, bölümleri Petri kabından slayttaki sıvıya teker teker aktarın. Ardından, boya fırçasını kullanarak bölümleri slayt üzerinde düz olacak şekilde dikkatlice düzenleyin. Slayttaki fazla sıvıyı bir P1000 pipeti ile dikkatlice temizleyin ve ardından vakum aspirasyonu yapın.

Slayttaki tüm fazla sıvı çıkarıldıktan sonra, her bölüme hemen bir damla montaj ortamı eklemek için bir transfer pipeti kullanın ve slaytın üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin. Montaj ortamının birkaç dakika yayılmasına izin verin ve ardından lamel altından çıkan fazla montaj ortamını vakum aspirasyonu ile çıkarın. Daha sonra, lamellerin dört kenarını da şeffaf oje ile kapatın.