Purkinje Hücrelerini İnsan Ölüm Sonrası Beyincik Dokusundan İzole Etmek için Lazer Yakalama Mikrodiseksiyonu

Purkinje hücresi, granül ve moleküler hücre katmanlarını içeren bir insan ölüm sonrası serebellar dokusunu alın.

Kısmen donmuş gömme ortamı içeren bir kriyostat numune tutucusuna yerleştirin.

Dokuyu sabitleyerek ortamın tamamen donmasına izin verin.

Bu düzeneği kriyostat kesme koluna aktarın ve dokunun kriyostat sıcaklığına alışmasına izin verin.

Dokuyu bıçağa yaklaştırın ve korteks katmanlarını ortaya çıkarmak için kesin.

Bıçağın üzerine bir viraj önleyici plaka yerleştirin ve serebellar bölümler elde edin.

Bu bölümleri bir membran slaytına aktarın.

Doku fiksasyonu ve dehidrasyonu için artan etanol konsantrasyonlarında inkübe edin.

Ardından, ksilen içinde inkübe edin.

Slaytı kurutun ve bir UV lazer yakalama mikroskobu aşamasına yerleştirin.

Toplama kapağını serebellar dokunun üzerine yerleştirin.

Mikroskobik olarak, Purkinje hücrelerine odaklanın.

Lazeri kullanarak, daha fazla analiz için Purkinje hücrelerini yakalayın ve toplayın.

İlk olarak, kesit almak için küçük bir doku parçası kesin ve bölümün yaklaşık% 95 serebellar korteks olduğundan emin olun. Kalan dokuyu kuru buza veya eksi 80 santigrat derecede bir dondurucuya geri koyun. Ardından, yavaş dairesel hareketlerle aynanın üzerine yavaşça OCT eklemeye başlayın. Aynayı kaplayan yaklaşık üç milimetre yüksekliğinde bir höyük olana kadar OCT katmanları oluşturun.

OCT kısmen donmuşsa, ancak merkezde hala bir miktar sıvı varsa, dokuları höyüğün üzerine yerleştirin. Dokuların tamamen donana kadar 1 ila 2 dakika OCT'nin üzerinde oturmasına izin verin. Ardından, donmuş OCT ve doku ile aynayı kriyostat kesme koluna aktarın. Dokuyu kesme bıçağıyla aynı hizada olacak şekilde ayarlayın ve dokuların yeni sıcaklığa uyum sağlaması için 20 dakika kesme kolunda

En kritik adım, dokunun kriyostat kesme kolunda gerektiği kadar uzun süre kalmasına izin vermektir. Doku parçalanırsa, Purkinje hücresinin görselleştirilmesi çok zor olacaktır. Dokunun daha hızlı alışmasını sağlamak için daha küçük, daha ince doku parçaları kullanmanızı öneririm.

Bundan sonra, dokuyu yavaşça bıçağa yaklaştırın. Doku bıçağa ulaştığında, düzeltme işlemine başlayın. Korteks katmanları görünene kadar dokuyu 2 ila 3 kez kesin.

Ardından, viraj önleyici plakayı kriyostat bıçağının hemen üzerine yerleştirin ve hizalayın. 14 mikrometre kalınlığında 4 ila 6 bölüm kesin, düzgün kesilmiş bölümlerin rulo önleyici plakanın altında düz olacağına dikkat edin. Kesilen bölümleri kriyostat aşaması boyunca yatay olarak hizalayın.

Tüm doku parçalarını aynı anda almak için bir sürgü açın. Dokuyu bölümlere ayırdıktan hemen sonra, slaytı 2 dakika boyunca buz üzerinde% 70 etanol içeren bir slayt tutucuya yerleştirin. Slaytı 45 saniye boyunca buz üzerinde %95 etanol içeren bir sürgü tutucuya aktarın.

Ardından, slaytı oda sıcaklığında 2 dakika boyunca %100 etanol içeren bir sürgü tutucuya yerleştirin. Slaytı oda sıcaklığında 1 numaralı ksilen içeren sürgü tutucuya 3 kez batırın. Ardından, slaytı 5 dakika boyunca oda sıcaklığında ksilen 2 içeren bir sürgü tutucuya yerleştirin. Slaytları temiz bir çeker ocakta dik tutun ve en az 30 dakika kurumaya bırakın.

İlk olarak, kapak toplama kolundaki mikroskop aşamasını temizlemek için dekontamine RNase kullanın. Eldivenli ellerle, slaytı mikroskobun üzerine yerleştirin ve toplama koluna 500 mikrolitrelik opak bir kapak yerleştirin. Düşük bir büyütmede, opak kapağı serebellar dokunun üzerine hizalayın ve kapağın göz merceğinde görüntülenen tüm alanı kapladığından emin olun.

Serebellar katmanları görselleştirmek için 5 kez ila 10 kez hedef kullanın. İmleci, moleküler katman ve granül hücre katmanının kesiştiği bölümün üzerine getirin. 40 kat büyütmeye geçin ve Purkinje hücrelerini görselleştirin. Ardından, onları yakalamaya başlayın.