Aşağı akış analizi için bir fare beyninin işlenmesi

Taze hasat edilmiş bir fare beynini alın ve hızlı doku koruması için önceden soğutulmuş izopentan içinde hızlı dondurun.

Daha sonra, dilimleme sırasında soğuk bir ortamı korumak için beyni, korteks tarafı yukarı bakacak şekilde donmuş bir beyin matrisine aktarın.

Beynin matris sıcaklığına dengelenmesine izin verin. Simetrik kesitler sağlamak için matriste sagital ve transvers sinüsler boyunca hizalayın.

Soğutulmuş bıçakları beyne yerleştirin ve doğru hizalamayı sağlayın.

Ardından, tek tip beyin bölümleri elde etmek için bunları eşit şekilde aşağı bastırın.

Bıçakları bölümleriyle birlikte çıkarın ve rostral tarafı yukarı bakacak şekilde donmuş bir cam plaka üzerine yerleştirin.

Rostraldan kaudal oryantasyona kadar olan bölümleri doğru anatomik sırayla düzenleyin. Şimdi onları ayırın.

Uygun bir beyin referansı kullanarak, ilgilenilen bölgeyi bulun ve bölümden çıkarın.

Eksize edilen dokuyu aşağı akış analizi için önceden soğutulmuş bir şişeye aktarın.

Ötenazi uygulanmış yetişkin CD-1 vahşi tip farelerden beyinleri çıkardıktan sonra, dokuyu kuru buzla önceden soğutulmuş sıvı nitrojen veya izopentan içinde 60 saniye dondurun ve -80 santigrat derecede saklayın.

Dokuyu incelemeden 24 saat önce, çözülmüş dondurucu paketlerinin bir yığınına temiz bir beyin matrisi yerleştirin ve matrisin kenarlarını iki dondurucu paketi arasına sıkıştırın, tıraş bıçağı yuvalarının alt kısmı ile paketlerin üst kısmı arasında yaklaşık yarım santimetre bıraktığınızdan emin olun.

Yalıtılmış bir kutuyu üstten yaklaşık 5 santimetreye kadar buzla doldurarak diseksiyon için donmuş bir cam plaka ayarlayın. Ardından üstüne 2,5 santimetrelik bir kuru buz tabakası yerleştirin ve üzerini siyah plastik örtü ile örtün. Plastiğin üzerine bir cam plaka yerleştirin ve plakanın kenarlarına kuru buz yerleştirin.

Donmuş beyin matrisini dondurucudan çıkarın ve beyin korteksi tarafı yukarı bakacak şekilde matrise yerleştirin. Dokunun 10 dakika boyunca kutudaki sıcaklığa dengelenmesine izin verin ve bu süre zarfında kapağı açık tutun. Beynin matristeki konumunu ayarlamak için soğuk forseps kullanın, böylece sagital sinüs ve enine sinüs bloğun dik olukları ile aynı hizada olur.

Beyin yerine oturduğunda, soğutulmuş bir tıraş bıçağını merkezine yakın bir yere yerleştirin ve dokuya yaklaşık 1 milimetre bastırın. Ardından, beynin her iki ucuna soğutulmuş bir bıçak yerleştirin ve matrisin içine kadar bastırın. Ardından, rostral uca soğutulmuş bıçaklar eklemeye başlayın, bunları birer birer yuvalara yerleştirin ve dokuya 1 milimetre hafifçe bastırın. Kuyruk ucuna doğru ilerleyerek 1 milimetre aralıklarla bıçak eklemeye devam edin.

Tüm bıçaklar yerine oturduğunda, parmaklarınızla, avuç ucunuzla veya keskin olmayan bir cisimle üstüne bastırın ve doku içinde hareket ettirmek için yavaşça bir yandan diğer yana sallayın. Bıçaklar yuvaların dibine ulaştığında, bıçak grubunun her iki tarafını kavrayın ve ileri geri sallayarak matristen kurtarın.

Bıçak grubunu serbest bıraktıktan sonra, rostral tarafı yukarı bakacak şekilde cam plakaya yerleştirin ve daha kolay ayırma için numuneleri daha fazla dondurmak için yığının yanına veya üstüne kuru buz koyun. Ardından, yığını keskin kenarları aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve yığını başparmak ve parmaklar arasında kaydırarak bıçakları ayırın.

Cam plakalar üzerindeki bölümü rostraldan kaudal olacak şekilde hizalayın ve dokuyu parmaklar arasında esneterek veya ikinci bir soğutulmuş bıçakla ayırarak bıçaklardan ayırın. Bazen, doku bir bıçağın her iki tarafına da yapışabilir ve rostral-kaudal oryantasyonu korumak için özen gösterilmelidir.

Diseksiyona başlamadan önce, Allen Mouse Brain Atlas'ı veya başka bir referansı açın ve ilgilenilen bölgeleri belirlemek için gerekli yer işaretlerini bulun. Bölümü çevirmek için soğutulmuş forseps veya bıçaklar kullanın ve ilgilenilen bölgenin bölüm boyunca tutarlı olduğundan emin olun.

Temiz bir neşter veya zımba ile bölüme kesin, metali nazikçe ama sıkıca dokuya itin, kesimi yapmak için ileri geri sallayın. İlgilenilen bölgeyi hasat ettikten sonra, etiketli önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik tüplere koyun ve -80 santigrat derecede saklayın.