Donmuş Sıçan Beyin Dokusundan Tek Hücreli Süspansiyon Elde Edilmesi

Donmuş sıçan beyin dokusunun bir bölümünü çözün.

Tampon ekleyin ve dokuyu kıyın. Daha sonra tampon içeren bir tüpe aktarın ve karıştırın.

Karışımı santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Dokuya proteolitik bir enzim çözeltisi ekleyin ve geniş çaplı bir pipet kullanarak yeniden süspanse edin.

Hücre dışı matrisi parçalamak için karışımı inkübe edin ve nöral hücreleri gevşetin.

Karışımı santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Doku parçalarını soğutulmuş bir tamponda yeniden süspanse edin ve hücreleri ayırmak için tekrar tekrar pipetleyin.

Döküntülerin ve ayrışmamış hücrelerin çökelmesine izin verin, ardından tek hücreli süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın.

Hücreleri buz gibi soğuk etanole aktarın ve karıştırın. Hücreleri sabitlemek ve geçirgen hale getirmek için onları kuluçkaya yatırın.

Süspansiyonu santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Daha fazla analiz için nöral hücreleri soğuk bir tamponda yeniden askıya alın.

Dokuyu kıymak için, numuneleri bir ila iki damla tampon A çözeltisiyle kaplamadan önce numunelerin soğuk bir cam plaka üzerinde en fazla 1 dakika çözülmesine izin verin. Daha sonra, bir tıraş bıçağını plakaya tamamen dikey tutarak, dokuyu her ortogonal yönde 100 kez kıyın. Dokuyu iyice kıymak için, dokuyu tampon A ile ıslak tutmak ve belirtilen kıyma sürelerini ve yönünü takip etmek çok önemlidir.

Doku diseksiyonu sırasında beyaz cevherin büyük bir kısmının uzaklaştırılması ve dokuyu tampon A ile kaplı tutmak, kıyma verimliliğini artırmak ve hücrelerin sağlığını korumak için kritik öneme sahiptir.

Doku iyice işlendiğinde, parçaları 1 mililitre soğuk tampon A içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için tıraş bıçağını kullanın ve kıyılmış dokuyu solüsyona batırmak için tüpü üç ila beş kez ters çevirin. Doku parçalarını tek bir hücre süspansiyonuna ayırmak için, numuneleri santrifüjleme ile peletleyin.

Süpernatanı atın, ardından mikrotüpün iç duvarına yavaşça 1 mililitre soğuk, taze çözülmüş enzim çözeltisi ekleyin ve kıyılmış doku parçalarını dağıtmak için her bir peletin tamamını hemen aspire etmek ve dağıtmak için büyük bir uç çapında pipet kullanın. Ardından, peletlerin tüp tabanlarına yapışmasını önlemek için mikrotüpü hızlı bir şekilde ters çevirin ve numuneyi 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca uçtan uca karıştırarak inkübe edin.

Sindirimin sonunda, tüpü tekrar santrifüjleyin ve hücrelere 0.6 mililitre soğuk tampon A ekleyin. Aynı pipet ucunu kullanarak, peletleri hemen beş kez aspire edin ve dağıtın, ardından 1,3 milimetrelik bir cam pipet seçin ve numuneleri 10 kez nazikçe titre etmek için kullanın.

Kalıntıların ve ayrışmamış hücrelerin tüpün dibine çökmesini sağlamak için numuneyi 2 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, toplanan süpernatantın ilk tüpünden 800 mikrolitre hücreyi, ilk iki etanol tüpünün her birine aktarın.

Numuneleri karıştırmak için tüpleri ters çevirin. Daha sonra numuneleri her 5 dakikada bir ters çevirerek karıştırarak 15 dakika buz üzerine koyun. Kuluçka sonunda hücreleri santrifüjleyin. Daha sonra sadece mikrotüpün duvarına dokunarak, her bir süpernatantın son 50 mikrolitresi hariç hepsini yavaşça çıkarmak için bir mikropipet kullanın.