Fare Beyin Dokusundan Hücre Zarı Proteinlerinin Palmitoilasyon Durumunun Değerlendirilmesi

Fare beyin dokusundan hücre zarı proteinlerini alın.

Bu proteinler, sistein kalıntılarına bağlı bir yağ asidi olan palmitoil grupları ile translasyon sonrası modifikasyon sergiler.

Bir indirgeyici tampon ekleyin ve palmitoillenmemiş sisteinler arasındaki bağları koparmak ve onları açığa çıkarmak için yüksek bir sıcaklıkta inkübe edin.

Açıkta kalan sisteinlere bağlanan ve sadece palmitoillenmiş sisteinleri reaktif bırakan bir bloke edici reaktif ile inkübe edin.

Çözeltiyi aktarın, kloroform, metanol ve deiyonize su ile karıştırın, proteinleri çökeltmek için santrifüjleyin ve safsızlıkları giderin. Ardından, metanol, santrifüj ekleyin ve kalan kirleticileri atın.

Bir tampon ekleyin, peleti çözündürmek için sonikat yapın, ardından çözünmeyen malzemeleri santrifüjleyin ve çıkarın.

Palmitoillenmiş sisteinlerden palmitoil gruplarını çıkarmak için bir yarma reaktifi uygulayın.

Kloroform-metanol çökeltmesini tekrarlayın ve safsızlıkları giderin.

Bloke edilmemiş sisteinlere bağlanan ve palmitoillenmiş proteinleri tanımlamaya yardımcı olan bir polimer ile inkübe edin.

Kloroform-metanol çökeltme işlemini tekrarlayın ve bağlanmamış polimerleri çıkarın.

İzole edilen proteinlerin palmitoilasyon durumunun daha fazla analizi için peleti yeniden askıya alın.

İlk olarak, çözündürülmüş proteini 25 mikrolitre TCEP içinde 55 santigrat derecede 60 dakika inkübe ederek disülfid bağlarını bozun. Daha sonra, çözeltiyi oda sıcaklığında üç saat boyunca 12.5 mikrolitre NEM stok çözeltisi ile inkübe ederek serbest sisteinleri bloke edin.

Ardından, kloroform-metanol çökeltme işlemine başlayın. Protein çözeltisini 1.5 mililitrelik tüpten, sallanan bir kova rotorunda mütevazı bir hızda santrifüjlenebilen bir polipropilen veya cam tüpe aktarın. 2 mililitre metanol ekleyin ve kısaca girdaplayın. 1 mililitre kloroform ekleyin ve kısaca girdaplayın. Ardından, 1,5 mililitre deiyonize su ekleyin ve tekrar kısa bir süre girdaplayın.

Gerekirse, iyice karıştırmayı sağlamak için tüpü ters çevirin. Numuneleri sallanan bir kova rotorunda 30 dakika boyunca 3.000 kez G ve 25 santigrat derecede santrifüjleyin. Çözeltinin üst fazını bir tüpte dikkatlice çıkarın ve atın. 1,5 mililitre metanol ekleyin. Opak protein krepini parçalamamaya dikkat ederek, tüpü nazikçe ters çevirerek nazikçe ama iyice karıştırın.

Numuneyi sallanan bir kova rotorunda 10 dakika boyunca 3.000 kez G ve 25 santigrat derecede santrifüjleyin. Bir cam serolojik pipet kullanarak, protein krepini bozmadan çözeltinin üst fazının mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Peleti 1 mililitre metanol ile dikkatlice durulayın ve en az 10 dakika kurumaya bırakın.

Kloroform-metanol çökeltmesi tamamlandıktan sonra, protein çökeltisini 125 mikrolitre tampon A'da yeniden süspanse ederek palmitoil tiyoester bağlarının bölünmesine başlayın. Yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü kısaca sonikleştirin ve daha sonra çözünmeyen materyali çıkarmak için 13.000 kez G veya daha yüksek ve 10 dakika boyunca 25 santigrat derecede santrifüjleyin.

Çözündürülmüş proteini yeni 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve 375 mikrolitre tampon H veya tampon T ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 60 dakika inkübe ettikten sonra, kloroform-metanol çökeltmesini tekrarlayın. Korunmasız sisteinlere mPEG eklemek için, peleti 10 milimolar TCEP içeren 100 mikrolitre tampon A'da yeniden süspanse ederek başlayın.

Ardından süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 25 mikrolitre stok mPEG 5k solüsyonu ekleyin ve pipetleyerek karıştırın. Uçtan uca dönüşle oda sıcaklığında inkübe edin. 60 dakikalık inkübasyondan sonra, tekrar kloroform metanol çökeltmesi yaparak dahil edilmemiş mPEG 5k'yi çıkarın.

10 dakika boyunca 13.000 kez G ve 25 santigrat dereceden daha yüksek bir sıcaklıkta santrifüjleyin. Kalın topaklanan krepten kaçınarak üst fazı daha önce olduğu gibi dikkatlice çıkarın. 1 mililitre metanol ekleyin ve hafifçe ama iyice karıştırın. 10 dakika boyunca 13.000 kez G ve 25 santigrat dereceden daha yüksek bir sıcaklıkta santrifüjleyin.

Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 1 mililitre metanol ile durulayın. Yine, 10 dakika boyunca 13.000 kez G ve 25 santigrat dereceden daha yüksek bir sıcaklıkta santrifüjleyin. Peletin havayla kurutulmasından sonra, TCEP veya herhangi bir indirgeyici madde olmadan 50 mikrolitre tampon A içinde yeniden süspanse edilir.