JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:08 dk. • July 8th, 2025
Nöromüsküler kavşaklar veya NMJ'ler oluşturmak için motor nöronlar tarafından innerve edilen kaslardan oluşan Drosophila larvalarının vücut duvarını alın.
NMJ'deki postsinaptik kas zarı, birincil antikorlarla işaretlenmiş etkileşimli zara bağlı proteinleri içerir.
Tek sarmallı oligonükleotidlere konjuge edilmiş ikincil antikorlar içeren yakınlık ligasyon testi veya PLA ekleyin. Probların birincil antikorlara bağlanması için inkübe edin.
Bağlanmamış probları yıkayın.
Bağlayıcı oligonükleotidler ve ligaz enzimleri içeren ligasyon tamponu ile inkübe edin.
Etkileşen proteinlerin yakınlığı, problara konektör bağlanmasını kolaylaştırır. Ligaz daha sonra boşlukları kapatarak dairesel DNA oluşturur.
Bağlanmamış konektörleri yıkayın.
Dairesel DNA'yı yuvarlanan daire amplifikasyonu yoluyla amplifiye eden polimeraz içeren bir amplifikasyon çözeltisi ile inkübe edin.
Çözeltideki florofor etiketli dedektör probları, amplifiye edilmiş DNA'ya tavlanır ve uyarılma üzerine bir floresan sinyali üretir.
NMJ'de floresan olarak etiketlenmiş protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için vücut duvarını bir slayt üzerine monte edin.
Teste başlamak için, vücut duvarlarına% 1 BSA'da hem PLA probu anti-fare eksi hem de PLA probu anti-tavşan artı en az 200 mikrolitre toplam hacimde 1 ila 5 seyreltme ekleyin. 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Vücut duvarlarını her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkamak için yıkama tamponu A'yı kullandıktan sonra, ligaz çözeltisine 1 ila 40 oranında ligaz seyreltmesi ekleyin. 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.
İnkübasyonun ardından, amplifikasyon çözeltisine 1 ila 80 oranında bir polimeraz seyreltmesi eklemeden önce vücut duvarlarını her biri 2 dakika boyunca iki kez yıkamak için yıkama tamponu A'yı kullanın. 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Numuneleri görüntülemeye hazırlamak için, gövde duvarlarını her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkamak için yıkama tamponu B kullanın. Ardından, 1 dakika boyunca son bir yıkama yapmak için 100 X seyreltme yıkama tamponu B kullanın. Gövde duvarlarını en az 30 dakika boyunca birkaç damla montaj solüsyonunda dengeleyin.
İnce forsepsler kullanarak, vücut duvarlarını, tırnak etleri aşağı bakacak şekilde bir platform kızağına dikkatlice aktarın. Bunları, bir veya iki damla montaj çözeltisi içinde aynı yönde sıralar halinde yerleştirin. Hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat ederek müstahzarın üzerine 22 milimetreye 40 milimetrelik bir lamel yerleştirin. Ardından, slaytı kapatmak için şeffaf oje kullanın.