JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:42 dk • July 8th, 2025
Nöroblastom hücrelerinden izole edilen mitokondriyi, zar geçirimsiz, kalsiyum bağlayıcı floresan boya içeren bir tampona yerleştirin.
Mitokondrinin tamponda stabilize olmasına izin vermek için inkübe edin.
Kalsiyum içeren tampon ekleyin ve çalkalanarak inkübe edin.
Kalsiyum iyonları boya moleküllerine bağlanarak floresanslarına neden olur.
Bir floresan spektrometresi kullanarak boyanın floresansını gerçek zamanlı olarak izleyin.
Şimdi, düzenli aralıklarla kalsiyum içeren tampon enjekte edin.
Artan kalsiyum konsantrasyonu, mitokondriyal kalsiyum alımını teşvik ederek boyaya bağlanmak için mevcut serbest kalsiyum iyonlarını azaltır, bu da floresansın azalmasına neden olur.
Mitokondri maksimum kalsiyum depolama kapasitesine ulaştığında, daha fazla kalsiyum ilavesi mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneğinin (mPTP) açılmasını tetikler.
Bu gözenek açıklığı, mitokondriden kalsiyumu tampona salar, burada boyaya bağlanır ve floresansın artmasına neden olur.
Mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini yansıtan mPTP açılmasını indüklemek için gereken toplam kalsiyum miktarını belirleyin.
Potasyum klorür ortamını hazırlayın ve deneyden önce kalsiyum bağlayıcı yeşil floresan boyayı 0.5 mikromolar nihai konsantrasyona ekleyin. Mitokondriyal kalsiyum tutma kapasitesini belirlemek için, önce 0.5 mikromolar kalsiyum bağlayıcı yeşil floresan boya içeren potasyum klorür ortamında 1 mililitre izole mitokondriyi 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın.
Mitokondriyi, oda sıcaklığında 6 oyuklu plakadaki kalsiyum bağlayıcı yeşil floresan boyada inkübe edin. 1 dakika boyunca ortam ışığından koruyun. İnkübasyonun ardından, miligram mitokondriyal protein başına 200 nanomol kalsiyum eklemek için otomatik dağıtım ayarını kullanarak, 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 20 milimolar kalsiyum klorür çözeltisinin 4 mikrolitre alikotunu ekleyin.
506 nanometre uyarma dalga boyu ve 531 nanometre emisyon dalga boyu ile 2 dakika boyunca her üç saniyede bir floresan değişikliklerini izlemek için bir floresan spektrometresi kullanın. Plaka, yazılım tarafından kontrol edilen okumalar arasında 3 saniye boyunca 600 RPM'de çalkalama ile donatılmıştır. Her oyuğa ilave bir 4 mikrolitre 20 milimolar kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin, ardından floresan değişikliklerini her 3 saniyede bir 2 dakika boyunca izleyin.