Dopamin Nöronlarını Hedeflemek için Fare Beyin Dokusu Kesitlerinin İmmünohistokimyası

Dopamin sentezi için anahtar bir enzim olan tirozin hidroksilazı eksprese eden dopamin nöronlarını içeren fare beyin dokusu bölümleriyle polimer kaplı bir slayt alın.
Düzgün boyama sağlamak için bölümleri hidrofobik bir kalemle ana hatlarıyla belirtin.
Doku morfolojisini korumak için dokuyu bir aseton-metanol çözeltisine sabitleyin.
Hücre zarlarını geçirgen hale getirmek için deterjan içeren tamponla durulayın.
Dopamin nöronlarında tirozin hidroksilazı hedefleyen birincil antikorlarla inkübe edin, ardından bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.
Floresan boya etiketli ikincil antikorlar, nükleer boya ve RNaz inhibitörleri ekleyin.
İnkübasyon sırasında, ikincil antikorlar birincil antikorlara bağlanır, nükleer boyalar çekirdeği etiketler ve RNaz inhibitörleri RNazları inaktive eder.
Tampon ile durulayın. Ardından, doku bölümlerini artan etanol konsantrasyonlarında dehidre edin.
Dokuyu temizlemek için ksilen içinde inkübe edin.
İşlenen doku kesitleri artık hedef dopamin nöronlarının hassas bir şekilde görüntülenmesine ve diseksiyonuna izin veren lazer yakalama mikrodiseksiyonu için hazırdır.

İmmünohistokimyayı gerçekleştirmek için, dokuyu özetlemek ve kurumasını sağlamak için hidrofobik bir kalem kullanın. Daha sonra, 1'e 1 asetonlu bir metanol çözeltisinde, dokuyu 10 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede sabitleyin. Dokuyu dondurucudan çıkardıktan sonra, bölümleri PBS'de 100 ila 200 mikrolitre tirozin hidroksilaz antikoru ve% 1 triton ile 10 dakika boyunca örtün.

Ardından, bölümleri Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş 100 ila 200 mikrolitre keçi antirabbit IgG ile kaplamadan önce slaytları durulamak için %1 tritonlu PBS kullanın. Beş dakika inkübe edin ve ardından slaytları iki kez durulamak için PBS'yi kullanın. Daha sonra, bu videoda daha önce gösterildiği gibi, numuneleri kademeli bir RNaz içermeyen etanol serisinde her biri 30 saniye boyunca dehidre edin. Ksilen içinde bir dakika ve ikinci bir yıkamada beş dakika inkübe edin. LCM için kullanmadan hemen önce slaytları çıkarın ve kurumaya bırakın.