JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 5:13 dk • April 28th, 2025
Karanlıkta adapte olmuş, anestezi uygulanmış, transgenik, beyaz gözlü bir sinek alın.
Sinek, gözün fotoreseptörlerindeki eGFP etiketli TRPL iyon kanallarını ifade eder.
Karanlıkta, TRPL, fotoreseptörlerin mikrovillusu olan rabdomeresin zarlarına lokalize olur.
Basınçlı hava kullanarak, sineği bir pipet ucuna baş üstü itin.
Ucu kesin ve sineği geriye doğru itin.
Tekrar kırpın ve sineği sadece başı dışarı çıkana kadar ileri doğru itin.
Bir slayta yapıştırılmış modelleme kilinin ucunu hareketsiz hale getirin ve göz radyal olarak mikroskop objektifine bakacak şekilde bir floresan mikroskop aşamasına yerleştirin.
Objektife bir damla su ekleyin, ardından göze değene kadar indirin.
Fotoreseptörlerin görüntülerini yakalayın.
Rabdomarelerdeki, hücre gövdesindeki ve arka plandaki floresan yoğunluklarını ölçün.
Hücre gövdesine TRPL translokasyonunu indüklemek için sineği turuncu ışıkla aydınlatın.
Görüntüleme ve floresan ölçümlerini tekrarlayın.
Hücre gövdesine TRPL translokasyonunu gösteren azaltılmış rabdomeral floresan sonrası gözlemlemek için görüntüleri karşılaştırın.
Öldürücü olmayan bir varyasyonda bir sinek hazırlamak için, buz anestezi uygulanmış sineği kafa üstü 200 mikrolitrelik bir pipet ucuna aktarın ve sineği basınçlı hava ile dikkatlice uca doğru itin. Ardından, bir neşter kullanarak pipet ucunu başın hemen önünde kesin. Ve cımbız kullanarak, sineği pipet ucuna birkaç milimetre dikkatlice itin.
Pipet ucunu tekrar kesin. Ve basınçlı hava ile sineği uca doğru geri itin, böylece sineğin yalnızca başı pipet ucundan dışarı çıkar. Bir parça hamuru bir nesne slaytına yapıştırdıktan sonra, pipet ucunu sol veya sağ göz yukarı bakacak şekilde içine bastırın. Mikroskop altında gözün doğru yönlendirildiğinden emin olun. Görüntü alımı için bir suya daldırma hedefi seçin.
Ölümcül olmayan bir varyasyon durumunda, suya daldırma hedefinin alt tarafına büyük bir damla soğutulmuş su yapıştırmak için bir laboratuvar pipeti kullanın. Hazırlanan sinek ile nesne slaytını dikkatlice mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, suya daldırma hedefini su yüzeyine temas edene veya sineğin gözü damlaya değene kadar manuel olarak indirin.
Ardından, ışık yolunu mikroskop kamerasına doğru değiştirin ve canlı bir görüntü oluşturun. Kameranın odağını yeniden ayarlayın ve gözün mikroskop objektifine radyal olarak bakması gerektiğini göz önünde bulundurarak gözün yönünü değerlendirin. Aşırı doygunluğu algılamak için arama tablosu yazılımını kullanın.
Pigmentsiz sinekler söz konusu olduğunda, pozlama süresini, en parlak pikseller her görüntü için doygunluk sınırının hemen altında olacak şekilde ayarlayın. Bir görüntü kaydedin ve kaydın ilgili tüm meta verilerini arşivlemek için ham dosya olarak kaydedin. Ardından, görüntüyü nokta TIFF formatında dışa aktarın.
Suya daldırma mikrograflarının rabdomarelerindeki bağıl EGFP floresansını ölçmek için Analiz Et'e tıklayarak ImageJ ayarlarını yapın. Ardından, ölçümleri ayarlayın ve yalnızca ortalama gri değer kutusunu işaretleyin. Dosya'ya ve ardından Aç'a tıklayarak nokta TIFF görüntüsünü içe aktarın. Odaktaki görüntünün temsili bir bölgesini seçin ve Control ve Plus tuşlarına art arda basarak %200 ila %300 arasında büyütün.
Ardından, Oval aracını seçin. Shift tuşuna basarken, görüntüde bir floresan rabdomeden önemli ölçüde daha küçük dairesel bir seçim oluşturun. Ardından, ImageJ ana penceresindeki araç çubuğunun altında görüntülenen tam boyutu arayın. Dairesel seçim içindeki floresan yoğunluklarını ölçmek için, klavyedeki ok tuşlarıyla daireyi ilk rabdomere taşıyın ve Analiz Et'e tıklayın, ardından ölç'e tıklayın.
Ölçülen gri değeri listeleyen bir sonuç penceresi açılacaktır. 2 ila 6 arasındaki rabdomere ölçümlerine devam edin ve ayrıca arka plan sinyalini ölçün. Pigmentli olmayan sinekler söz konusu olduğunda, karşılık gelen hücre gövdesi alanlarının ek ölçümlerini yapın. İki ommatidianın daha floresansını ölçün, bu da üç teknik kopya ile sonuçlanır. Analiz edilen ommatidiayı kalem aracını kullanarak işaretleyin ve bu görüntüyü dokümantasyon için kaydedin.
Sonuç penceresinden ölçülen gri değerleri seçin ve kopyalayın ve daha fazla hesaplama için bunları elektronik tablo yazılımına yapıştırın. Floresan yoğunluk değerlerini kökenlerine göre kategorinin rabdomere, hücre gövdesi ve arka planına göre sıralayın ve her kategoriden ortalama yoğunluğu hesaplayın. Daha sonra, pigmentli olmayan gözler için ilk formülü ve pigmentli gözler için ikincisini kullanarak rabdomelde bulunan nispi EGFP miktarını hesaplayın.