Nörodejeneratif Protein Aşırı Ekspresyonu ile Maya Hücrelerinde Histon Modifikasyonlarının Saptanması

Nörodejeneratif hastalıklarla bağlantılı proteinleri aşırı eksprese eden maya hücrelerinin süspansiyonu ile başlayın.

Bu aşırı eksprese edilmiş protein, DNA paketleme proteinlerindeki veya kimyasal kısımları olan histonlardaki modifikasyonlardan sorumludur.

Sodyum hidroksit ve beta-merkaptoetanol ekleyin ve ardından buz üzerinde inkübe edin.

Sodyum hidroksit ve beta-merkaptoetanol hücreleri parçalayarak histonlar da dahil olmak üzere hücre içi proteinleri serbest bırakır.

Proteinleri toplamak için lizatı santrifüjleyin. Süpernatanı atın.

Protein peletine bir yükleme boyası ekleyin ve onları denatüre etmek için ısıtın.

Bu denatüre proteinleri ve bir protein işaretleyiciyi jel ve elektroforez üzerine yükleyerek boyutlarına göre ayırın.

Proteinleri bir zara elektrotransfer edin, yıkayın ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bir engelleme tamponu ekleyin.

Özellikle modifiye histonlara bağlanan birincil antikorları ekleyin.

Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın ve primer antikorlara bağlanan floresan ikincil antikorlarla inkübe edin.

Farklı bir floresan bant, nörodejeneratif proteinlerin aşırı ekspresyonunu gösteren histon modifikasyonlarını doğrular.

Hücreleri western blot analizi