$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Nörodejeneratif hastalıklarla bağlantılı proteinleri aşırı eksprese eden maya hücrelerinin süspansiyonu ile başlayın.
Bu aşırı eksprese edilmiş protein, DNA paketleme proteinlerindeki veya kimyasal kısımları olan histonlardaki modifikasyonlardan sorumludur.
Sodyum hidroksit ve beta-merkaptoetanol ekleyin ve ardından buz üzerinde inkübe edin.
Sodyum hidroksit ve beta-merkaptoetanol hücreleri parçalayarak histonlar da dahil olmak üzere hücre içi proteinleri serbest bırakır.
Proteinleri toplamak için lizatı santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
Protein peletine bir yükleme boyası ekleyin ve onları denatüre etmek için ısıtın.
Bu denatüre proteinleri ve bir protein işaretleyiciyi jel ve elektroforez üzerine yükleyerek boyutlarına göre ayırın.
Proteinleri bir zara elektrotransfer edin, yıkayın ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bir engelleme tamponu ekleyin.
Özellikle modifiye histonlara bağlanan birincil antikorları ekleyin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın ve primer antikorlara bağlanan floresan ikincil antikorlarla inkübe edin.
Farklı bir floresan bant, nörodejeneratif proteinlerin aşırı ekspresyonunu gösteren histon modifikasyonlarını doğrular.
Hücreleri western blot analizi için parçalamak için, 100 mikrolitre damıtılmış suda yeniden süspansiyon yapmadan önce maya hücresi peletlerini buz üzerinde çözdürün. Her hücre örneğine 300 mikrolitre 0.2 molar sodyum hidroksit ve 20 mikrolitre 2-Merkaptoetanol ekleyin. Ve pipetleme ile peletleri yeniden süspanse edin.
Buz üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve numuneleri 100 mikrolitre yükleme boyası içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra numuneleri bir ısıtma bloğunda 10 dakika kaynatın. Numuneler parçalanırken, iki jeli bir jel tutucuya yerleştirin ve iç hazneyi çalışan tamponla ve dış hazneyi iki jel çizgi işaretine kadar doldurun.
Numuneler hazır olduğunda, 10 oyuklu% 12 poliakrilamid jelin her bir oyuğuna 15 mikrolitre hücre lizis çözeltisi yükleyin ve protein merdiveni şeridine 5 mikrolitre protein merdiveni ekleyin. Jeli 150 voltta yaklaşık 45 dakika veya yükleme boyası ön kısmı jelin dibine ulaşana kadar çalıştırın.
Jel çalışırken, transfer tamponunda jel başına iki fiber ped ve metanolde jel başına bir poliviniliden florür veya PVDF membranı ıslatın. Jel hazır olduğunda, zarı durulayın ve tamponu transfer edin. Ve yarı kuru bir transfer aparatı hücresinin altına önceden ıslatılmış bir fiber ped yerleştirin, ardından PVDF membranı, jel ve ikinci önceden ıslatılmış fiber pedi yerleştirin.
Ardından gücü 1 saat boyunca 150 miliampere ayarlayın. Protein transferinin sonunda, damıtılmış su ile kısa bir durulama için zarı transfer aparatından çıkarın. Durulanmış membran protein tarafını yukarı bakacak şekilde küçük bir boyama kutusuna yerleştirin ve zarı hafif sallama ile oda sıcaklığında 1 saatlik bir inkübasyon için Tris tamponlu salin veya TBS bloke edici tampon ile örtün.
Bloke edici inkübasyonun sonunda, membranı gece boyunca bir anti-maya histonu ve TBS'de 4 santigrat derecede modifikasyona özgü antikor ve uygun bir nükleer yükleme kontrol antikoru ile inkübe edin.
Ertesi sabah, membranı TBS'de dört kez yıkayın, yıkama başına oda sıcaklığında sallanarak% 0.1 polisorbat 20 ile beş dakika boyunca takviye edin. Son yıkamadan sonra, lekeyi uygun ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, ardından TBST'de dört adet 5 dakikalık yıkama ve TBS'de tek başına sallama ile beş dakikalık bir yıkama yapın.
Ardından lekeyi 2 dakika boyunca floresan western blot görüntüleme sisteminde görüntüleyin.