ELISA Kullanarak Nörodejeneratif Hastalıkla İlişkili Protein α-Sinükleinin Saptanması

Yüksek tuzlu bir tampona daldırılmış, nörodejeneratif hastalıkla ilişkili yanlış katlanmış bir nöronal protein olan mutasyona uğramış α-sinükleini aşırı eksprese eden transgenik bir fareden alınan beyin dokusu ile başlayın.

Dokuyu büyük bir havaneli ile homojenize edin, ardından dokuyu bozmak ve α-sinüklein de dahil olmak üzere hücre içi proteinleri serbest bırakmak için küçük bir havaneli uygulayın.

Homojenatı bir tüpe ve santrifüje aktarın. Protein içeren süpernatanı toplayın ve bir tamponla seyreltin.

Bu süpernatanı, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bir bloke edici madde ile önceden işlenmiş α-sinükleine özgü antikorlarla kaplı bir mikroplakaya ekleyin.

Normal ve mutasyona uğramış α-sinükleinin bağlanmasına izin vererek çalkalama ile inkübe edin.

Plakayı yıkayın, ardından mutasyona uğramış α-sinükleine özgü tespit antikorları ekleyin ve çalkalama ile inkübe edin.

Tekrar yıkayın ve enzime bağlı antikorları ekleyin, ardından çalkalama altında inkübasyon yapın.

Alt tabaka ekleyin ve çalkalama altında karanlıkta inkübe edin. Substrat, bir renk değişikliği oluşturmak için enzim ile reaksiyona girer.

Reaksiyonu bir asitle durdurun ve mutasyona uğramış α-sinükleini ölçmek için absorbansı ölçün.

Beyin homojenatlarını hazırlamak için, aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi, beklenen yüzde homojenata ulaşmak için diseke edilen beyin bölgelerine yeterli miktarda HS tamponu ekleyin. Borosilikat cam tüp ve A ve B olmak üzere iki havaneli içeren bir doku öğütücü kullanarak, ezilecek bir beyin bölgesini tüpe dökün. Ve sonra havaneli A ile dokuyu ayırmak için 10 kez homojenize edin.

Ardından havaneli B'ye geçin ve 20 kez daha homojenize edin. Bir transfer pipeti ile homojenatı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve homojenizasyonu kalan beyin örnekleriyle tekrarlayın. Numuneleri 1.000 g'da beş dakika, dört santigrat derecede santrifüjleyin. Sonra süpernatantları toplayın ve 200 mikrolitrelik alikotlara bölün.

100 mikrolitre antikor kaplama çözeltisi ile, 96 kuyulu mikroplakanın kuyularını kaplayın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, kuyucuklara 300 mikrolitre PBST ekleyin ve plakaları beş kez yıkamak için bir plaka yıkayıcı kullanın. Oda sıcaklığında çalışırken, ilerlerken, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre T20 PBS engelleme tamponu ekleyin ve plakaları beş kez yıkamak için PBST'yi kullanmadan önce plakaları bir saat boyunca 150 RPM'de çalkalayın.

BSA'nın %1'i olan PBST'yi kullanarak, burada listelenen yönergeleri kullanarak beyin homojenatlarını seyreltin. Ve her kuyucuğa 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, plakaları beş kez yıkamak için PBST'yi kullanmadan önce oda sıcaklığında ve 150 RPM'de iki saat inkübe edin.

Son yıkamadan sonra, metin protokolünün ikinci tablosunda listelendiği gibi PBST ve% 1 BSA'da seyreltilmiş gerekli alfa sinüklein tespit antikorlarını ekleyin. Plakaları daha önce olduğu gibi beş kez yıkamadan önce oda sıcaklığında ve 150 RPM'de bir saat inkübe edin.

Daha sonra, PBST,% 1 BSA'da 1 ila 8.000'e seyreltilmiş anti-fare veya anti-tavşan IGG HRP konjugatları ekleyin. Ve plakaları beş kez yıkamadan önce 150 RPM'de bir saat inkübe edin. Daha sonra her oyuğa 100 mikrolitre TMB çözeltisi ekleyin ve karanlıkta 15 dakika boyunca 150 RPM'de inkübe edin. Kuyucuk başına 100 mikrolitre bir normal hidroklorik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Ardından, 450 nanometrede absorbansı ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın.