İnsan Beyin Dokusundan İzole Edilen Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi

Ölüm sonrası insan beyin dokusundan izole edilen nöromelanin granüllerinden (NMG'ler) türetilen peptitlerle başlayın.

Dopamin üreten nöronlarda bulunan NMG'ler, nöromelanin pigmenti, proteinler ve lipitler içerir.

Hidrofobik ligandlarla işlevselleştirilmiş silika bazlı sabit faz içeren yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) sütunu alın.

Peptitleri sütuna yükleyin.

Hidrofobik peptitler, hidrofilik olanlardan daha güçlü bir şekilde kolona bağlanır.

Sütundan bir elüsyon tamponu geçirin.

Önce daha az hidrofobik peptit elüte olurken, daha sonra daha fazla hidrofobik peptit elüte olur.

Ayrıştırılan peptitler, kütle spektrometresinin elektrosprey iyonizasyon kaynağına girer ve burada yüklü peptit iyonlarına iyonize olurlar.

İyonize peptitler daha sonra kütle-yük oranlarına göre ayrıldıkları kütle analizörüne girerler.

Seçilen bir peptit iyonu çarpışma hücresine yönlendirilir ve kütle-yük oranları tekrar ölçülen daha küçük iyonlara parçalanır.

Son olarak, veriler NMG örneğinde bulunan proteinleri tanımlamak için bir referans veritabanıyla karşılaştırılır.

Metinde açıklandığı gibi triptik sindirim gerçekleştirdikten sonra, 200 ila 400 nanogram numune peptidini inert kütle spektrometrik cam flakon girişlerinde tanımlanmış %0,1 TFA hacminde çözerek numuneyi HPLC-MS analizi için hazırlayın. Düşük numune miktarı nedeniyle konsantrasyon belirlemesi uygulanamıyorsa, toplam iyon akımını karşılaştırarak aynı numune yüklemesini doğrulayın.

Proteomik ham veri analizine başlamak için, ham dosyaları yazılıma yüklemek üzere Yükle'ye tıklayın. Örnek adları atamak için Deney Ayarla'ya tıklayın. Gruba özgü parametreleri tanımlamak için, değişken modifikasyonlar olarak Deamidation NQ, Oksidasyon M ve Karbaminometilasyon N-Term'i seçerek modifikasyonları ekleyin. Ve sonra sabit modifikasyon olarak Karbaminometilasyon C'yi ekleyin. Sindirim sekmesinde sindirim enzimi olarak tripsin seçin.

Etiketsiz Niceleme sekmesinde. LFQ seçeneğini ekleyin. Ve 10'dan fazla dosya işlenecekse, işlem süresini kısaltmak için hızlı LFQ seçeneğini seçin. Gruba özgü diğer tüm parametrelerin fabrika ayarlarında kaldığından emin olarak, Global Parametreler sekmesine ilerleyin ve Diziler sekmesindeki uniprot.org'den türetilen FASTA dosyasını ekleyin. Tanımlayıcı kuralını uygun şekilde değiştirin ve Homo sapiens için 9606 taksonomi kimliğini ekleyin.

Protein ölçümü için benzersiz ve jilet peptitleri seçin. Ardından, etiketsiz Miktar Tayini sekmesinde protein miktar tayini için bir ölçü olarak iBAQ seçeneğini ekleyin. Diğer tüm genel parametrelerin fabrika ayarlarında kaldığından emin olun ve Başlat'a tıklayın. Analiz başarıyla gerçekleştirildikten sonra, protein grubunun .txt çıktısını alın.