JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:01 dk. • April 28th, 2025
Tümör mikroçevresinin matrisini taklit eden hücre dışı polimer ve adezyon proteinleri içeren bir bazal membran matrisi ile kaplanmış düz tabanlı çok kuyulu bir plaka ile başlayın.
Pediatrik bir beyin tümöründen türetilen glioma hücrelerinin nörosferini içeren bir ortam tanıtın ve kuyuda merkezi olarak konumlandırıldığından emin olun.
Matris, nörosferin kuyuya bağlanmasını destekler.
Spesifik olmayan floresansı en aza indirmek için bir arka plan baskılayıcı reaktifi ekleyin.
Ardından, yeşil florofor konjuge anti-CD44 antikorlarını tanıtın.
Plakayı, hücrenin fizyolojik koşullarını koruyan bir inkübatör içinde bulunan canlı hücre görüntüleme sistemine aktarın.
Zamanla, glioma hücreleri adezyon proteinleri ile etkileşime giren hücre adezyon proteini CD44'ü eksprese eder.
Bu, hücre sinyal yolunu aktive eder ve nörosferden hücre göçünü kolaylaştırır.
Florofor konjuge anti-CD44 antikorları, glioma hücreleri üzerinde eksprese edilen CD44'e bağlanarak onları floresan yapar.
Nörosferden uzaklaşan yeşil floresan hücrelerin görünümü, glioma hücre göçünü doğrular.
Kuyular BMM ile kaplandıktan sonra bir P200 ucu kesin. Seçilen her kuyucuktan 50 mikrolitre hücre ortamı ve NS alın ve kaplı, düz, dipli bir kuyuya aktarın. Her bir kuyucuktaki NS'nin varlığını ve konumunu görsel olarak kontrol edin. Her bir oyuğa yavaşça 50 mikrolitre seyreltilmiş BSR ve ALR antikoru ekleyin, reaktiflerin karışması için iki ila üç dakika bekleyin. Ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, çoğaltılmış NS'lerin çoğunun kuyuda merkezi olarak bulunduğundan emin olun. Herhangi bir kabarcık olmadığından emin olduktan sonra, plakayı daha önce gösterildiği gibi canlı hücre analiz cihazına yavaşça aktarın.
Canlı hücre analiz cihazı yazılımında, Alınacak Zamanlama seçeneğini belirleyin. Ardından, artı sekmesine tıklayın ve plakaları metin el yazmasında belirtildiği gibi aralıklarla taramak için Programa Göre Tara'yı seçin. Yazılım penceresinde, gemi oluşturun veya geri yükleyin ve ardından Yeni seçeneğine tıklayın. Migrasyon tahlili için Seyreltme Klonlama tarama türünü, 4X hedefini ve faz ve yeşili seçin. Plaka tipini seçin ve taranacak kuyucukları plaka haritası üzerinde vurgulayarak tanımlayın. Ardından, tarama frekansını ayarlayın. Programa Ekle'ye tıklayın ve taramayı başlatın.