JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:38 dk. • April 28th, 2025
İnce bağırsak nöroendokrin tümör sferoidlerini bir tüpte alın.
Hücreleri korumak için sabitleyici bir solüsyon ekleyin.
Fiksatifi yıkamak, santrifüjlemek ve tamponla değiştirmek için.
Kalan fiksatifleri çıkarmak için süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Hücresel zarlara nüfuz etmek ve spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için deterjan ve bloke edici bir madde içeren bir tampon ekleyin.
Fazla deterjanı ve bloke edici maddeyi çıkarmak için tamponla yıkayın.
Nöroendokrin hücreye özgü hedef proteine bağlanan primer antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın.
Primer antikorlara bağlanan florofor etiketli ikincil antikorlar ekleyin.
Fazla antikorları çıkarmak için tamponla durulayın.
Çekirdeği boyamak için bir boya içeren bir montaj ortamı ekleyin.
Sferoidleri bir kızağa aktarın ve bir kapak kızağı ile monte edin.
Spesifik proteinleri ifade eden sferoidin nöroendokrin hücrelerini görselleştirmek için bir Floresan mikroskobu kullanın.
500 mikrolitre paraformaldehit ekleyerek ve 15 dakika inkübe ederek organoidleri düzeltin. İnkübasyondan sonra, kültürü iki kez 1 mililitre PBS ile yıkayın. Kültüre nüfuz etmek için% 3 BSA ve% 0.1 Triton X-100 ile 500 mikrolitre PBS ekleyin. Tüpü beş dakika inkübe edin, ardından organoidleri 1 mililitre PBS ve% 3 BSA ile üç kez yıkayın.
Ardından, kültürü bir saat boyunca birincil antikorlarla inkübe edin, ardından yıkamaları PBS ve BSA ile tekrarlayın. İkincil antikorlarla inkübe edin ve yıkamaları tekrarlayın, tüm süpernatanları aspire ettiğinizden ve attığınızdan emin olun.
Sferoidleri görüntülemek için, DAPI içeren 5 mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve 5 mikrolitre sferoidi bir cam slayta aktarmak için bir P20 pipeti kullanın. Slaytı bir kapak fişi ile kapatın ve 10, 20 ve 40 kez hedefleri kullanarak bir floresan mikroskobu ile görüntü alın.