JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:28 dk. • April 28th, 2025
Fagositik aktivite sergileyen mikroglia benzeri hücreler içeren çok kuyulu bir plaka alın.
Çekirdekleri etiketlemek için nükleer bir leke ile kuluçkaya yatırın.
Negatif kontrol kuyusuna bir aktin polimerizasyon inhibitörü ekleyin.
İnkübasyon sırasında, inhibitör aktin filamentlerine bağlanarak aktin polimerizasyonunu ve fagositozu inhibe eder.
Plakayı düşük sıcaklıklarda tutun ve pH'a duyarlı boya etiketli insan sinaptozomları ekleyin - nöral sinaptik terminallerin izole edilmiş parçaları.
Hücre-sinaptozom etkileşimlerini teşvik etmek, ancak erken alımı önlemek için plakayı düşük sıcaklıklarda santrifüjleyin.
Plakayı canlı hücre görüntüleme sistemine aktarın.
Test kuyusunda, sinaptozomlar fagositoza uğrar ve lizozomlarla birleşerek fagolizozomlar oluşturur. Lizozomal asidik ortam boyayı aktive ederek floresansına neden olur.
Zamanla, test kuyusunda, daha fazla sinaptozom yutulur ve floresanda daha fazla artışa neden olur.
Bununla birlikte, negatif kontrol kuyusunda, aktin polimerizasyonu inhibe edilir ve sinaptozom alımını önler. Elde edilen minimal floresan, aktin aracılı fagositoza floresan bağımlılığını doğrular.
Tahlil gününde, oyuk başına 40 mikrolitre besiyerini çıkarın ve 10 mikrolitre nükleer boyama solüsyonu ekleyin. Plakayı iki saat inkübe edin. Etiketli sinaptozomları buz üzerinde çözün ve bir dakika boyunca bir su sonikatörü kullanarak nazikçe sonikasyon yapın. Yine, sinaptozomları hemen buzun üzerine yerleştirin. Etiketli sinaptozomları ve IMG tam ortamını 50 mikrolitre ortam başına 1 mikrolitre sinaptozomda seyreltin.
Negatif kontrol için, aktin polimerizasyonunu ve dolayısıyla fagositozu inhibe etmek için IMG tam ortamında 60 mikromolar sitokalasin D hazırlayın. Daha sonra, 10 mikromolar nihai konsantrasyon için her bir oyuğa bu çözeltiden 10 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve 10 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Plakayı buz üzerinde tutun ve 50 mikrolitre sinaptozom içeren ortam ekleyin.
Plakayı 10 santigrat derecede üç dakika boyunca 270 kez g'de santrifüjleyin ve görüntüleme elde edilene kadar plakayı buz üzerinde tutun. Plakayı canlı bir hücre görüntüleme okuyucusuna yerleştirin ve analiz edilecek kuyuları seçin. Ardından, 20x objektif lensi seçin. Ardından, odak Işık Yayan Diyot veya LED yoğunluğunu, entegrasyon süresini ve parlak alan ve mavi kanalların kazancını ayarlayın. Sinaptozomların floresansı, ilk zaman noktasında ihmal edilebilir olmalıdır.
Bir montajda kuyucuk başına alınacak tek tek döşeme sayısını seçin. Kuyu merkezinde, toplam kuyu alanının yaklaşık% 5'ini görüntüleyen 16 karo elde edin. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve görüntüleme için istenen zaman aralığına ayarlayın.