Fosforile Nöronal Potasyum-Klorür Kotransporter 2'nin Western Blotting ile Tespiti

Nöronal klorür seviyelerini düzenleyen potasyum-klorür kotransporter 2 veya KCC2 proteinleri içeren bir hücre lizatı alın.

Düzenleyici bölgelerdeki fosforilasyon, nöronal aktiviteyi modüle ederek KCC2 fonksiyonunu bozar.

Lizatı, fosforile KCC2'yi hedefleyen antikorlarla konjuge edilmiş boncuklara ekleyin. Bağlanmaya izin vermek için inkübe edin, ardından bağlanmamış proteinleri ve hücresel kalıntıları çıkarmak için yıkayın.

KCC2'yi serbest bırakmak için yüksek sıcaklıkta denatüre edici bir tampon uygulayın, ardından boncukları ayırmak için santrifüjleyin.

KCC2 içeren süpernatanı bir elektroforez jeli üzerine yükleyin. Fosforile KCC2'nin varlığını doğrulamak için proteinleri bantlara ayırın.

Bantları bir zara aktarın, ardından spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için bir engelleme solüsyonunda inkübe edin.

Fosforile KCC2'yi hedefleyen primer antikorlarla inkübe edin.

Yıkayın, ardından birincil antikorları etiketlemek için enzim etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin.

Tekrar yıkayın, ardından ışık üretmek için enzimle reaksiyona giren kemilüminesans bir substrat ekleyin.

Lizattaki fosforile KCC2'yi ölçmek için ışık yoğunluğunu ölçün.

300 mikrolitre protein G sefarozunu bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Ardından, çözeltiyi 500 G'de iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, 500 mikrolitre PBS ekleyin ve iyice girdaplayın. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve bu adımı tekrarlayın.

Ardından, 1 miligram anti-KCC2 treonin 906 ve anti-KCC2 treonin 1007 antikorlarını 200 mikrolitre protein G sefaroz boncuklarıyla karıştırın, ardından PBS ile hacmi 500 mikrolitreye çıkarın. Titreşimli bir platform üzerinde salladıktan veya tekerleği 4 santigrat derecede iki saat döndürdükten sonra, PBS ile iki yıkamayı tekrarlayın.

Hücre lizatları üzerinde protein miktar tayini yapın ve yıkanmış boncuklara 1 miligram hücre lizatı ekleyin ve eğirmeden önce uçtan uca bir döndürücüde inkübe edin. 150 milimolar sodyum klorür içeren PBS ile üç yıkama yapın, ardından son peleti 100 mikrolitre LDS numune tamponunda yeniden süspanse etmeden önce 200 mikrolitre PBS ile üç yıkama yapın.

Tüpleri oda sıcaklığında bir rotor çalkalayıcıda beş dakika çalkalayın. Bunları bir ısıtma bloğunda inkübe edin ve süpernatanı jel yüklemesi için kullanmadan önce santrifüjleyin. Batı lekesi döküm aparatını monte edin ve jeli dökmek için taze hazırlanmış% 8 ayırma jelini dökün ve döküm camının üstünden yaklaşık 2 santimetre boşluk bırakın. Kuruluma 200 mikrolitre mutlak izopropanol ekleyin ve 60 dakika oda sıcaklığında bekletin.

İzopropanolü bir pipet kullanarak çıkarın ve jeli yaklaşık 200 mikrolitre damıtılmış su ile dikkatlice durulayın. Döküm kurulumuna taze hazırlanmış %6'lık istifleme jeli ekledikten sonra, kuyu tarağına nazikçe yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Ardından, döküm jeli elektroforez tankına sabitleyin.

Çalışan tamponu tanka döktükten sonra, ilk kuyucuğa 5 mikrolitre moleküler ağırlık işaretleyicisi ve SDS-PAGE jelinin her bir oyuğuna eşit miktarda protein yükleyin. Boş kuyuları LDS ile doldurun ve jeli 120 voltta yaklaşık 90 ila 120 dakika çalıştırın. Nitroselüloz membranı %20 metanol içeren transfer tamponu ile rehidre edin.

Jeli ve zarı transfer tamponuyla durulayın ve hazırlama yığınının üzerine nazikçe yayın. Aktarılacak sandviçi bu sırayla düzenleyin, negatif elektrot, sandviç köpüğü, filtre kağıdı, durulanmış SDS-PAGE jeli, durulanmış nitroselüloz membran, filtre kağıdı, sandviç köpüğü, pozitif elektrot. Bittiğinde, monte edilmiş sandviçi transfer tankına istifleyin ve 90 dakika boyunca 90 voltta veya 360 dakika boyunca 30 voltta çalıştırın.

Kuru zarı bir engelleme tamponu kullanarak oda sıcaklığında 1 saat bloke edin. Membranları, oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 santigrat derecede bloke edici tamponda uygun primer antikor ve beta aktin dilüsyonları ile inkübe edin. Ardından, her biri 5 dakika boyunca üç yıkama TBST yapın.

Yıkanmış membranı, bir bloke edici tampon içinde seyreltilmiş ikincil bir antikor ile 60 dakika boyunca inkübe edin ve üç TBST yıkamasını tekrarlayın. Bittiğinde, yıkanmış zarı görüntüleme kartına yerleştirin. Sinyalleri geliştirmek için, görüntüleme kartını görüntüleme için görüntüleme sistemine aktarmadan önce, her bir geliştirilmiş kemilüminesans reaktifinin eşit hacimlerinde karıştırılarak hazırlanan çözeltiyi zar üzerine yayın.