JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 5:25 dk. • April 28th, 2025
Nöronal klorür seviyelerini düzenleyen potasyum-klorür kotransporter 2 veya KCC2 proteinleri içeren bir hücre lizatı alın.
Düzenleyici bölgelerdeki fosforilasyon, nöronal aktiviteyi modüle ederek KCC2 fonksiyonunu bozar.
Lizatı, fosforile KCC2'yi hedefleyen antikorlarla konjuge edilmiş boncuklara ekleyin. Bağlanmaya izin vermek için inkübe edin, ardından bağlanmamış proteinleri ve hücresel kalıntıları çıkarmak için yıkayın.
KCC2'yi serbest bırakmak için yüksek sıcaklıkta denatüre edici bir tampon uygulayın, ardından boncukları ayırmak için santrifüjleyin.
KCC2 içeren süpernatanı bir elektroforez jeli üzerine yükleyin. Fosforile KCC2'nin varlığını doğrulamak için proteinleri bantlara ayırın.
Bantları bir zara aktarın, ardından spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için bir engelleme solüsyonunda inkübe edin.
Fosforile KCC2'yi hedefleyen primer antikorlarla inkübe edin.
Yıkayın, ardından birincil antikorları etiketlemek için enzim etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin.
Tekrar yıkayın, ardından ışık üretmek için enzimle reaksiyona giren kemilüminesans bir substrat ekleyin.
Lizattaki fosforile KCC2'yi ölçmek için ışık yoğunluğunu ölçün.
300 mikrolitre protein G sefarozunu bir mi
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin