Bir fare arteriolar endotelinde kalsiyum dinamiği ve membran potansiyel değişikliklerinin analizi

Bir fare beyninden alınan bir arteriolar endotel tüpünü sürekli tampon akışı olan bir odaya sabitleyin.

Odayı bir kayıt kurulumuna yerleştirin.

Kalsiyuma duyarlı bir floresan boya ekleyin. Boyanın hücresel alımına izin vermek için inkübe edin.

İçselleşmemiş boyayı çıkarmak için yıkayın.

Bir endotel hücresine bir elektrot yerleştirin ve dinlenme zarı potansiyelini kaydedin.

Boyaya hücre içi kalsiyum bağlanmasını kolaylaştırmak için banyo sıcaklığını fizyolojik bir sıcaklığa yükseltin.

Boyayı uyarın ve temel hücresel kalsiyum seviyelerini ölçmek için floresansı ölçün.

Endotel hücreleri üzerindeki spesifik G-proteinine bağlı reseptörlere bağlanan ve bir sinyal kaskadı başlatan bir ilaç tanıtın.

Bu kaskad, kalsiyum iyonlarını endoplazmik retikulumdan sitoplazmaya salar, kalsiyum-boya bağlanmasını ve floresansı arttırır.

Yüksek sitoplazmik kalsiyum seviyeleri ayrıca potasyum kanallarını aktive ederek potasyum iyonu akışını kolaylaştırır ve zar potansiyelini azaltır.

Verileri kaydedin.

Artmış floresan ve azalmış membran potansiyeli, fonksiyonel bir endotel tüpünü gösterir.

Endotel membran potansiyelini ölçmek için, dört kez objektiften bakarken, keskin elektrot ucunu arteriyel endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine bir mikromanipülatör ile akan fizyolojik tuz çözeltisine dikkatlice yerleştirin. Yavaş yavaş, büyütmeyi 400 kata çıkarın ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın. Mikromanipülatörü kullanarak, keskin bir elektrotun ucunu endotel tüpünün hücrelerinden birine yavaşça yerleştirin ve bir elektrometre kullanarak VM kaydetmeye başlayın.

Endotelyal dinlenme VM'si eksi 30'dan eksi 40 milivolta stabil olduğunda, deneysel hedefe göre istenen farmakolojik ajanları uygulayın. Endotel tüpünü, plazma zarı veya istenen organel için floresan izleyici ile 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika boyunca yükleyin. Hücreleri taze süperfüzyon fizyolojik tuz çözeltisi ile yıkayın ve canlı hücreleri mikroskop altında ilgili boyaların uyarma dalga boyunda görüntüleyin.