JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:34 dk • April 28th, 2025
Sıçan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinin veya RBMEC'lerin tek katmanlı kültürüyle odacıklı bir slayt alın.
Hücreler, kan-beyin bariyerinin endotel tabakasını taklit eden aktin hücre iskeletine bağlı sıkı bağlantı proteinleri ile bağlanır.
Ortamı oksijeni alınmış glikoz içermeyen bir ortamla değiştirin, ardından slaytı bir hipoksi odasına yerleştirin.
Oksijen ve glikozun bulunmaması ATP sentezini engeller. Kalan ATP, nükleotid türevlerine ayrılır.
ATP tükenmesi kalsiyum pompalarını engeller ve oksidoredüktaz enzimlerini aktive eden hücre içi kalsiyumu yükseltir.
Ardından, oksijenli bir ortamla doldurun, ardından slaydı oksijenli bir inkübatöre yerleştirin. Aktive edilmiş oksidoredüktazlar, nükleotid türevlerini parçalamak için yeniden giren oksijeni kullanır ve reaktif oksijen türleri veya ROS üretir.
ROS, sıkı bağlantı proteinleri arasındaki etkileşimleri bozar ve aktin hücre iskeletini stres liflerine dönüştüren sinyal yollarını indükleyerek hücre-hücre etkileşimlerini zayıflatır.
Hücreler arası etkileşimleri bozulmuş tek katman analiz için hazır.
Hazırlık olarak, hipoksi hücre kültürü sistemini üreticinin talimatlarına göre kurun ve kalibre edin. Oda ortamı %95 azot, %5 karbondioksit ve 37 santigrat derece olmalıdır. Şimdi, glikoz içermeyen DMEM'i 4 ila 6 saat boyunca hipoksi odasına yerleştirerek oksijenden arındırın. Daha sonra, ortamlarını oksijensiz glikoz içermeyen DMEM ile değiştirerek hücreleri strese sokmaya başlayın. Ve sonra hücreleri iki saat boyunca hipoksi odasına yerleştirin. İki saat sonra, hücreleri sıçan beyni endotel hücresi tam ortamına geri koyun. Daha sonra, hücreleri bir saat boyunca normal koşullara döndürerek yeniden oksijenlendirin.