JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 7:03 dk. • April 28th, 2025
Deterjan, kalsiyum ve proteaz inhibitörleri içeren bir tampondaki nörosfer hücrelerini alın.
Deterjan hücreleri geçirgenleştirirken, inhibitör kromatine bağlı hedef proteini korumak için proteazları inaktive eder.
Nükleaz ekleyin ve inkübe edin. Nükleaz, kromatini sindirmek için kalsiyum kullanır.
Kalsiyumu şelatlayan ve nükleazı etkisiz hale getiren EDTA içeren bir tampon ekleyin.
Hücreleri parçalamak için lizis tamponu ekleyin ve kromatini serbest bırakın.
Süpernatanı santrifüjleyin ve toplayın.
Hedef proteine özgü antikorları ekleyin ve rotasyonla inkübe edin. Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.
Antikoru hedefleyen manyetik boncukları tanıtın ve rotasyonla inkübe edin.
Spesifik olarak bağlanmamış DNA'yı ayırmak için lizis tamponu ekleyin.
Boncukları manyetik olarak yakalayın ve süpernatanı çıkarın.
Spesifik olarak bağlanmamış proteinleri ayırmak için yüksek tuzlu bir tampon ekleyin.
Boncukları manyetik olarak yakalayın ve süpernatanı çıkarın.
Bir stabilizasyon tamponu ekleyin, boncukları manyetik olarak yakalayın ve kirleticileri çıkarın.
Proteinleri sindirmek için bir proteinaz-K tamponunda yeniden süspanse edin ve DNA'yı serbest bırakın.
Nörosferler toplandıktan sonra, 5 dakika boyunca 300 kez g'de immünopresipitasyon başına 1 kez 10 ila 6 nörosfer hücresi santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı boşaltın ve nörosfer peletini bir mililitre dengeli tuz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu düşük protein bağlayıcı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve ardından daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.
Ardından, süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 1 kere 10 ila 6 hücreye kadar 1 kez proteaz inhibitör kokteyli ile 1'e 100 takviye edilmiş 95 mikrolitre sindirim tamponunda yeniden süspanse edin. Topaklanmayı önlemek ve herhangi bir kabarcık oluşturmasını önlemek için hücreleri hemen yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra 5 mikrolitre 0.1x mikrokokal nükleaz ve 145 mikrolitre sindirim tamponunu karıştırın ve 6 hücreye 1 çarpı 10'da 5 mikrolitre seyreltilmiş mikrokoksiaz ekleyin. Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve tüpü tam olarak 12 dakika boyunca 37 santigrat derece ısı bloğuna yerleştirin.
Kromatini parçalamak için mikrokokal nükleaz sindirimi en kritik adımdır. ChIP için yüksek bir çözünürlük elde etmek için uygun kromatin parçalanması önemlidir. Bu adımın başarılı olmasını sağlamak için, aşırı sindirimin meydana gelmemesini sağlamak için birden fazla numuneyi birer birer inkübe edin.
12 dakika sonra, 6 hücreye 1 kere 10'da 10 mikrolitre 10x mikrokokal nükleaz durdurma tamponu ekleyin. Numuneler bu noktadan itibaren buz üzerinde tutulmalıdır. Mikrokokal nükleaz sindirilmiş numunenin biyo-analizör analizi, DNA'nın çoğunun mono, di ve tri-nükleozomlara parçalandığını gösterir. Daha sonra, 6 hücreye 1 kez 10'da 1 proteaz inhibitörü kokteyli ile 1'den 100'e kadar takviye edilmiş 110 mikrolitre 2x RIPA tamponu ekleyin.
Tüpü karıştırmak için hafifçe vurun, ardından 4 santigrat derecede ve 1.700 kez g'de 15 dakika santrifüjleyin. Kromatin içeren süpernatanı normal 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Kromatini, her IP'nin 100 ila 200 mikrolitre hacme sahip olması için seyreltmek için 1 ila 1.000 arasında proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş RIPA tamponu kullanın. Ardından, giriş örneği olarak ChIP hacminin %10'una eşdeğer bir alikotu çıkarın.
Proteinaz-K ile takviye edilmiş 100 mikrolitre TE tamponu ekleyerek girişi hazırlayın ve 55 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Girişi bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırdıktan sonra, bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak girişin konsantrasyonunu ölçün. Sonuçları bir not defterine kaydedin. Her numune üzerinde gerçekleştirilecek olan IP başına 10 mikrolitre yıkanmış protein A ve G manyetik boncuk ekleyin ve 20 RPM'de dönerek 4 santigrat derecede bir saat inkübe edin.
Numuneyi manyetik bir tutucuya yerleştirin ve boncukların ayrılmasına izin verin. Ardından gereken hacmi yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. İstenilen antikoru her tüpe ekleyin ve ardından buharlaşmayı önlemek için kapakları plastik parafin filmle sarın. Numuneleri gece boyunca 4 santigrat derecede daha önce olduğu gibi döndürerek inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri 10 saniye boyunca 2000 kez g'de döndürün. Daha sonra her IP'ye 10 mikrolitre boncuk ekleyin ve 20 RPM'de dönerek 4 santigrat derecede üç saat inkübe edin.
Ardından numuneleri manyetik bir standa yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra her IP'ye proteaz inhibitörleri içeren 150 mikrolitre RIPA tamponu ekleyin ve 4 santigrat derecede 20 RPM'de 5 dakika inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, numuneleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra her IP'ye düşük konsantrasyonda proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 150 mikrolitre lityum klorür tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 20 RPM'de rotasyonla 4 santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçka süresinden sonra numuneleri manyetik bir standa yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin. Ardından süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra boncuklara proteaz inhibitörleri içermeyen 150 mikrolitre soğuk TE ekleyin ve 5 dakika boyunca 20 RPM'de dönerek 4 santigrat derecede inkübe edin. Son yıkama adımından sonra, numuneyi mililitre proteinaz-K başına 0,5 miligramlık nihai konsantrasyon ile desteklenmiş 100 mikrolitre TE tamponunda yeniden askıya alın ve bir saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin.