Fare Beyin Bölümlerinde Gen Ekspresyonunu Tespit Etmek için Çift Floresan In Situ Hibridizasyon Yapılması

Kimyasal olarak sabitlenmiş bir fare beyni bölümünü ele alalım.

FITC veya DIG ile etiketlenmiş bir geçirgenleştirme ajanı ve RNA probları içeren bir hibridizasyon karışımı ekleyin.

Hücre geçirgenliğine ve prob girişine izin vermek için inkübe edin.

Problar, oligodendrositlerde veya hedef olan ASPA mRNA'da her yerde eksprese edilen bir referans belirteç olan MBP mRNA üzerindeki tamamlayıcı dizilere bağlanır.

Bağlanmamış probları çıkarmak için yıkayın.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir engelleme tamponu ekleyin.

FITC işaretli probu hedefleyen HRP konjuge anti-FITC antikorlarını tanıtın.

Yıkayın, ardından FITC-tiramit ekleyin.

HRP, FITC-tiramidi, yakındaki proteinlere bağlanan ve floresan sinyalini yükselten oldukça reaktif bir forma oksitler.

Engelleme tamponunu yıkayın ve tekrar yerleştirin.

DIG işaretli probu hedefleyen alkalin fosfataz konjuge anti-DIG antikorları ekleyin.

Fast Red solüsyonunu yıkayın ve uygulayın.

Alkalin fosfataz, Fast Red'i defosforile ederek bir floresan çökelti oluşturur.

Floresan mikroskobu altında görselleştirin.

Mbp ve ASPA sinyallerinin birlikte lokalizasyonu, oligodendrositlerde ASPA ekspresyonunu gösterir.

İki probu hibridizasyon tamponunda seyre