$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Kimyasal olarak sabitlenmiş bir fare beyni bölümünü ele alalım.
FITC veya DIG ile etiketlenmiş bir geçirgenleştirme ajanı ve RNA probları içeren bir hibridizasyon karışımı ekleyin.
Hücre geçirgenliğine ve prob girişine izin vermek için inkübe edin.
Problar, oligodendrositlerde veya hedef olan ASPA mRNA'da her yerde eksprese edilen bir referans belirteç olan MBP mRNA üzerindeki tamamlayıcı dizilere bağlanır.
Bağlanmamış probları çıkarmak için yıkayın.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir engelleme tamponu ekleyin.
FITC işaretli probu hedefleyen HRP konjuge anti-FITC antikorlarını tanıtın.
Yıkayın, ardından FITC-tiramit ekleyin.
HRP, FITC-tiramidi, yakındaki proteinlere bağlanan ve floresan sinyalini yükselten oldukça reaktif bir forma oksitler.
Engelleme tamponunu yıkayın ve tekrar yerleştirin.
DIG işaretli probu hedefleyen alkalin fosfataz konjuge anti-DIG antikorları ekleyin.
Fast Red solüsyonunu yıkayın ve uygulayın.
Alkalin fosfataz, Fast Red'i defosforile ederek bir floresan çökelti oluşturur.
Floresan mikroskobu altında görselleştirin.
Mbp ve ASPA sinyallerinin birlikte lokalizasyonu, oligodendrositlerde ASPA ekspresyonunu gösterir.
İki probu hibridizasyon tamponunda seyreltin, önceden 65 santigrat dereceye ısıtın ve iyice karıştırın. Her slayta 300 mikrolitre hibridizasyon karışımı uygulayın ve fırında pişmiş bir lamel ile örtün. Daha sonra, slaytları gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 65 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, slaytları önceden ısıtılmış yıkama tamponu içeren bir Coplin kavanozuna aktarın ve slaytları 65 santigrat derecede iki kez 30 dakika yıkayın. Bundan sonra, slaytları oda sıcaklığında MABT yıkama solüsyonu ile üç kez 10 dakika yıkayın.
Bu adımda, doku bölümlerinin etrafına daireler çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Daha sonra, slaytları nemlendirilmiş bir odada ISH bloke edici tampon ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, slaytları gece boyunca 4 santigrat derecede yaban turpu peroksidaz konjuge anti-FITC antikoru ile inkübe edin.
Ardından, slaytları PBST içeren bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Her seferinde 10 dakika boyunca PBST'de üç kez yıkayın ve her seferinde yeni PBST ile değiştirin. Daha sonra slaytlara floresan tiramid ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Slaytları bir Coplin kavanozuna koyun ve PBST'de üç kez 10 dakika yıkayın.
Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca ISH engelleme tamponu ile inkübe edin. Ardından, slaytları gece boyunca 4 santigrat derecede bir alkalin fosfataz konjuge anti-DIG antikoru ile inkübe edin. Bundan sonra, her seferinde 10 dakika boyunca MABT ile üç kez yıkayın. Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca pH 8.2'de 0.1 molar Tris-HCL ile iki kez yıkayın.
Hızlı kırmızı çözeltiyi süzün ve slaytları nemlendirilmiş bir odada hızlı kırmızı çözelti ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Optimum gelişme süresi değiştikçe, çökelti oluşumunu izlemek için slaytları düzenli olarak bir floresan mikroskobu ile kontrol edin. Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca PBST ile üç kez yıkayın.