JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:04 dk. • April 28th, 2025
Kolin asetiltransferaz eksprese eden kolinerjik nöronlar da dahil olmak üzere nöronlar içeren sabit ve geçirgen fare beyin dilimlerini alın.
Dilimler, kolinerjik aksonlara lokalize hedef mRNA'ları tespit etmek için floresan in situ hibridizasyona tabi tutulur ve floresan mikroskobu ile tespit edilen floresan problar kullanılarak güçlendirilmiş sinyaller elde edilir.
Proteinler ve bir söndürme maddesi içeren bir bloke edici çözelti ekleyin. Proteinler spesifik olmayan bağlanmayı önler ve söndürme maddesi artık fiksatifleri nötralize eder.
Nöronal kolin asetiltransferazı hedef alan primer antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın.
Kolin asetiltransferaza bağlı primer antikorlara bağlanan florofor konjuge sekonjede sekonder antikorlarla inkübe edin.
Fazla antikorları çıkarmak için tamponla yıkayın, ardından tampon kalıntılarını gidermek için damıtılmış suda durulayın.
Çekirdekleri etiketlemek için dilimleri nükleer leke içeren montaj ortamıyla birleştirin.
Floresan mikroskobu kullanarak, spesifik antikorlarla boyanmış hedef mRNA sinyallerini ve kolinerjik aksonları görselleştirmek için dilimleri görüntüleyin.
Her dilimi, mililitre BSA, 100 milimolar glisin ve PBS'de% 0.25 Triton X-100 içeren 100 ila 200 mikrolitre bloke edici çözelti ile kaplayın. Her slaydı parafilm ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
İnkübasyonu takiben, slaytlara bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 100 ila 200 mikrolitre antikorda, burada bir anti-kolin asetiltransferaz antikoru kullanılır. Kaplandıktan sonra, parafilm ile slaytlar, dört santigrat derecede iki gün boyunca inkübe edilir. Beyin dilimlerinin kurumamasına dikkat edin. Gerekirse, inkübasyondan 24 saat sonra beyin dilimlerine anti-chAT antikor solüsyonunu tekrar uygulayın.
Slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1X PBS'de üç kez yıkadıktan sonra, slaytlara 100 ila 200 mikrolitre uygun Alexa konjuge ikincil antikoru ekleyin. Parafilm ile örtün ve ışıktan korunurken oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Bir saat geçtikten sonra, slaytları daha önce olduğu gibi her biri beş dakika boyunca 1X PBS'de üç kez yıkayın ve ardından bir kez damıtılmış suyla yıkayın. Kızakları DAPI içeren montaj ortamı ile monte edin. Ve sonra beyin dilimlerini floresan mikroskobu altında görselleştirin.