Name: FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Öğrenin, FlexStation 3 kullanarak TRPA1 kanallarının farmakolojik profillerini yüksek verimli kalsiyum testiyle nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, ağrı mekanizmaları ve ilaç geliştirme araştırmaları için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr teşekkür ederim. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris ve verdikleri destek için Olga Chumakova. FlexStation 3 sisteminin UTHSC Cytodynamic Görüntüleme Tesis bir parçası. Ayrıca Dr teşekkür. Scripps Araştırma Enstitüsü ve HEK293-hTRPA1 istikrarlı hücre hattı sağlamak için Novartis Araştırma Vakfı (GNF) Genomik Enstitüsü Ardem Patapoutian ve Michael Bandell. Araştırma NIH (MXZ için GM081658) ve Texas Tıp Merkezi Sindirim Hastalıkları Merkezi (HH) ve Mission Bağlan / TIRR Vakfı (HH) hibe kısmen desteklenmektedir.

1. 96-kuyucuğu Hücre hazırlıkları CDNA insan TRPA1 geçici trasfected HEK293 hücreleri için <ol><li> HEK293 hücrelerin% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (Invitrogen, 16.000-044) ile desteklenmiş 4.5 mg / ml glikoz (Thermo Scientific, SH3002201) içeren Dulbecco'nun Minimal Essential Orta 1-2 gün (DMEM), 50 adet için yetiştirilen / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin (Invitrogen, 15.140-163). Transfeksiyon gününde, hücre yoğunluğu% 70-90 ulaştırılması gerekmektedir. </li><li> Iyi 50 ul poli-L-ornitin (Sigma P3655, steril distile su içinde 20 mg / ml) ve 37 kuluçka ° C, en az 15 dakika boyunca pipetleme Coat 96-kuyucuğu. Dulbecco'nun Fosfat her biri de bir kez durulayın Mg 2 olmadan Tamponlu Salin (DPBS) + ve Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). Plaka, birkaç saat için hücre kültürü kaputu sol olabilir. </li><li> 96 plaka her kuyu için, 1.5 ml Eppendorf tüp 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31.985-070) 0.2 mg cDNA seyreltin. Aynı cDNA transfekte kuyu sayısına göre orantılı olarak büyütmek. Ayrıca 25 ul OPTI-MEM transfekte olmak için her sıra ayrı bir 1.5 ml Eppendorf tüp 0.4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11.668-019) sulandırmak. Transfekte için kuyu toplam sayısına göre bu kadar Ölçeği. </li><li> Kısaca vorteks seyreltilmiş cDNA ve Lipofectamine 2000 ve bunları yaklaşık 5 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Eşit hacimde sulandırılmış Lipofectamine 2000 seyreltilmiş cDNA, girdap içeren tüp transferi ve karışımı 15 dakika ila 2 saat oda sıcaklığında bekletin. Bu süre zarfında, 49 ul / poli-L-ornitin kaplı plaka Lipofectamine / cDNA 2000 karışımı aktarın. </li><li> HEK293 hücreleri (Adım 1.1) Trypsinize, bir hemasitometre veya Kontes otomatik hücre sayıcı (Invitrogen, C10227) kullanarak hücre yoğunluğu sayımı, ve 15 ml steril bir hücre istenilen miktarda transfer (genellikle yaklaşık ~ 125,000-150,000 hücre / kuyu) alt konik santrifüj tüpüne. 5 dakika için 1000 x RPM santrifüjleyin. % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile takviye DMEM kültür ortamı ~ 1,250,00-1,500,000 hücre / ml, ancak antibiyotik olmadan yeniden süspanse hücre. </li><li> Bir çok kanallı pipetter veya MicroFill Mikroplaka Dispenseri (Bio-Tek) kullanarak 2000 cDNA-Lipofectamine karışımı içeren her bir kuyunun 98 ul hücre süspansiyonu koyun. Plaka nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatör koymadan önce en az 30 dakika kaputu oturup edelim. Için 37 ° C,% 5 CO 2 ile 20-44 saat inkübe edin . </li></ol> Stably TRPA1 ifade HEK293 hücreleri için <ol start="8"><li> Adım 1.2 kat 96-kuyucuğu izleyin. </li><li> Cömertçe indüklenebilir HEK293-hTRPA1 hücre hattı (Invitrogen, Dr. A. Patapoutian (Scripps Araştırma Enstitüsü) tarafından sağlanan ve yabani tip HEK293 hücreleri (Adım 1.1) olarak aynı ortamda muhafaza ancak 5 mg / ml blasticidin ile desteklenmiş A1113902) ve 50 mg / ml hygromycin B (Invitrogen, 10.687.010). Hücre yoğunluğu yaklaşık% 90 ulaştığında, hücreler trypsinize hücre yoğunluğu saymak ve 5 dakika boyunca 1000 x RPM hücreler istenilen miktarda santrifüj. ~ 1.000.000 hücre / ml yoğunlukta doksisiklin (Fisher, BP26535, 0.25 mg / ml) ile takviye aynı kültür ortamında süspanse edin hücreleri. </li><li> Ul / iyi, çok kanallı pipetter veya MicroFill (Bio-Tek) kullanarak 100 poli-L-ornitin kaplı plakalar hücre süspansiyonu koyun. Plaka nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatör koymadan önce en az 30 dakika kaputu oturup edelim. 37 ° ° C'de,% 5 CO 2 - 16 24 saat. </li></ol> 2. Çözümler <ol><li> Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS), ekstrasellüler çözüm olarak kullanılır. (MM) içerir: 137 NaCl, 5.4 KCl, 0.25 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 pH 1N NaOH ile 7.4 'e ayarlanır MgCl 2, 10 glikoz, 10 Hepes,). </li><li> Fluo-4 tahlil tampon HBSS içinde probenesid 2 mM içerir. 0,5 N NaOH 250 mM stok probenesid (Sigma, P8761) olun. HBSS için 1:125 bir oranında seyreltilir. 1 N HCl ile pH 7.4 yeniden ayarlayınız. </li></ol> 3. Hücre yükleme Fluo-4 AM <ol><li> 1 mM stok solüsyonu 912 ul susuz DMSO 1 mg Fluo 04:00 (Invitrogen, F14202) eritin. Fluo-4 en az bir ay için stok çözelti -20 ° C'de saklanabilir AM. </li><li> 10 ul 1 mM karıştırın Fluo-4 10 ul Pluronic sonra F-127 (Invitrogen, P3000MP, DMSO içinde% 20 (w / v) solüsyonu) ve 5 ml Fluo-4 tahlil tamponu (Adım 2.2) tüm içeriği transfer ile AM (Sigma, A9418),% 0,1 Bovine serum albümin ile desteklenmiştir. </li><li> Mikroplak yıkayıcı (Bio-Tek gelen ELx405TM gibi) kullanarak 80 ul / 2 kez HBSS (Adım 1.7 veya 1.10) 96-kuyucuğu yetiştirilen hücreler yıkayın. </li><li> Fluo-4 Ul / çok kanallı bir pipetter veya MicroFill (Bio-Tek) kullanarak ve 37 plaka inkübe 50 (Adım 3.2) çözümü yükleme PM ° C 1 saat. </li><li> ELx405TM mikroplak yıkayıcı kullanarak Fluo-4 tahlil tampon (Adım 2.2.) Hücreleri 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, her bir kuyunun Fluo-4 tahlil tampon 80 ul bırakın. </li></ol> 4. Bileşik plaka hazırlanması <ol><li> 1 saat hücre yükleme dönemde, 3x Fluo-4 tahlil tampon istenilen son konsantrasyonlarının agonistleri (veya antagonistleri) 3x dilüsyonları bir dizi hazırlamak. </li><li> 96-iyi bir bileşik plaka seyreltilmiş bileşik çözümler Pipet 250-300 ul. FlexStation 3, bir defada tek bir sütun okur çünkü mümkün olduğunda bileşik plaka aynı sütun ve ilgili pozitif ve negatif kontroller bir bileşik seri dilüsyonları ettirmelisiniz. </li></ol> 5. Plaka okuma FlexStation 3 <ol><li> (FlexStation 3, bilgisayar ve SoftMax Pro 5.2 yazılım) sistemi açın </li><li> Deney yeni bir dosya adı ile kaydedin. Set-up, ESNEK modunu seçin ve aşağıdaki değerleri girin: </li></ol> Protokol # 1, agonist etkisi <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tablo 1"> Protokol # 2, antagonist etkisi <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tablo 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tablo 2"><ol start="3"><li> Yeni bir uç kutusu, bileşik plakası ve plaka okuma, 3 FlexStation uygun tepsilere yerleştirin ve "oku" butonuna tıklayın. FlexStation 3 Bir kerede bir sütun okumak ve önceden programlanmış zaman noktalarında bileşikler okuma kesmeden katacak. Bir sütun ve makine adım 5.2 'de kullanıcı tarafından programlanan tüm sütunlar okunur kadar yapılan bileşik eklemelerle sonraki sütun okumak için devam edecektir okuma bitirmek için yaklaşık 3 dakika (Protokol # 2 için 5 dakika) sürer. </li></ol> 6. Veri analizi <ol><li> Deneysel veriler SoftMax Pro 5.2 yazılımını kullanarak doğrudan veya kopyalanan ve Microsoft Excel gibi herhangi bir elektronik tablo programı içine yapıştırılan işlenebilir. TRPA1 agonist flufenamic asidi (FFA) konsantrasyon-yanıt eğrisi aşağıdaki en küçük kareler uydurma rutin kullanarak inşa edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Denklem 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 1"> Y gözlenen tepki olduğu, Y max normalize edilmiş maksimum tepki, C, ilgili ilaç konsantrasyonu, EC 50, yarı-maksimum bir tepki uyarılmış konsantrasyon ve n H görünürdeki Hill katsayısı. Varsayılan TRPA1 antagonisti bileşik Konsantrasyon-inhibisyon eğrisi FFA (100 mcM) sabit bir konsantrasyonu ve kademeli olarak aşağıdaki uyan en küçük kareler ile hesaplanan bileşik bileşik IC 50 değeri A. konsantrasyonu arttırarak elde edilir denklemi. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Denklem 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 2"> , Burada gözlenen yanıt Y ve Y maksimum pik yanıt normalize [Ant] karşılık gelen bileşik A toplama, IC 50 FFA-uyarılmış yanıt yarı-maksimum inhibisyonu üreten antagonist konsantrasyonu ve n H görünürdeki Tepesi katsayısı. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: TRPA1 + duyarlı boya Ca 2, Fluo-4 (1-2) ile tespit edilebilir kalsiyum akınına yol açar aktivasyonu Ca 2 +-geçirgen katyon kanal,. HEK293-hTRPA1 istikrarlı bir hücre hattı TRPA1 agonistleri ve antagonistleri konsantrasyon-yanıt ilişkileri incelemek için kullanılmıştır. Hücreler, Fluo-04:00 yüklenen 80 ul tahlil tampon yerleştirilir ve FlexStation 3 kullanılarak okunabilir. 30 s için temel floresan kaydettikten sonra, bir seri seyreltme TRPA1 agonist, FFA 40 ul, her istenilen nihai konsantrasyonu 3x akışkansal modülünün bir parçası olarak dahil bir multi-kanal pipetter aracılığıyla hücrelere ilave edildi FlexStation 3. Floresan değişiklikler ek bir 180 s. monitörize edildi Sırasıyla F ve F 0 faiz ve okuma başında zaman floresan değerlerdir - (F 0 F), her bir kuyu için göreceli Fluo-4 floresan değişiklikleri mesafe kadar taşınmış = ifade edildi. FFA konsantrasyonlarının bir dizi yanıt floresan değişikliklere zamanlı kurslar Temsilcisi izleri Şekil. 1. Maksimal yanıt düzeyleri benzer olmasına rağmen, alt FFA konsantrasyonlarda daha yüksek aktivasyon kinetiği açıkça daha hızlıdır, son dört FFA konsantrasyonları için dikkat edin. Bu nedenle, bu farklılıkları ayırt etmek için, konsantrasyon-yanıt ilişkisi üzerine ilk floresan artış oranları (eğim) FFA değişik konsantrasyonlarda (Şekil 2) ek ölçüm tarafından inşa edilmiştir. Yarım maksimal etkisiFFA ive konsantrasyonu (EC 50) 55.4 mcM (n = 3) olarak tespit edilmiştir. Varsayılan TRPA1 antagonisti test etmek için, bir bileşik, protokol # 2 (Adım 2) kullanarak benzer bir deney gerçekleştirdi. Bu durumda, bir dizi antagonisti dilüsyonlarının 30 s (3x istenilen son konsantrasyonlarının 40 ul) ilave edildi ve FFA (100 mcM son bir konsantrasyon için 300 mcM 60 ul) sonra 180 ler eklendi. Bileşik bir doz-yanıt bağımlı 4.3 mcM yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC 50) (n = 3) (Şekil 2) ile FFA TRPA1 hücreleri azalır. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> FFA insan TRPA1 Şekil 1. Konsantrasyon bağımlı aktivasyonu. İzler zamanla floresan FFA-uyarılmış artış (sadece ilk 60 s tepkiler FFA-uyarılmış yanıtlar hızlı kinetiği daha iyi göstermek için gösterilmiştir). Yüksek konsantrasyonlarda FFA ile floresan artış uyarılmış olduğunu lütfen unutmayınız çok düşük konsantrasyonlarda daha hızlı kinetik, zirve floresan seviyeleri benzer olmasına rağmen. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Konsantrasyon - FFA indüklenen floresan değişim ve bileşik stably HEK293 hücrelerinde ifade insan TRPA1 FFA yanıtı indüklediği inhibisyonu için tepki ilişkileri. Δ, konsantrasyon - FFA yanıt ilişkisi üzerine ilk normalize floresan artış oranları (eğim) FFA konsantrasyonları değişen ek ölçerek tespit edildi. O, varsayılan TRPA1 antagonisti FFA-uyarılmış kalsiyum yanıt inhibisyonu Konsantrasyon-yanıt ilişkisi, bileşik A.

<ol><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li>
<li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li>
<li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li>
<li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li>
<li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li>
<li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li>
<li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li>
<li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+concentrations+during+%22chemical+hypoxia%22+and+excitotoxic+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li>
<li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li>
<li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2%2B+-+and+membrane+potential-sensitive+dyes%3A+advantages+and+potential+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li>
<li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li>
<li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analgesic+drug%2C+tramadol%2C+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li>
<li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca%28v%293+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li>
<li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li>
<li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+%28Trp%29+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li>
<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Hücre içi Ca 2 +, nörotransmitter sürüm (3), kardiyak aksiyon potansiyeli (4), kas hücresi kasılma (5), hücre sinyal iletimi (6-7) ve eksitotoksik hücre ölümü (gibi pek çok fizyolojik ve patolojik koşullar, önemli bir rol oynar 8). Hücre içi Ca 2 + seviyeleri ölçümü fonksiyonel değişiklikler ve Ca 2 + geçirgen kanallar plazma zarı ya da hücre içi organelleri katkısı aydınlatmak için yardımcı olur Ca 2 + yukarıdaki süreçleri (9-13). Tahlil de, birçoğu, G-protein reseptör...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Peki, FlexStation pipetleyin İpuçları </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Peki Tabaklar </td><td> Greiner Bio-one </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Peki Temizle Düz Taban plakaları </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> PM fluo-4 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-ornitin </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probenesid </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albumini </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

flexstation kullanarak 3 trp kanal İşlevleri yüksek verimli tarama orta hücre tabanlı kalsiyum testi

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Moleküler Aygıtlar FlexStation 3, çok iyi plakaları otomatik floresan ölçüm yeteneğine bir masa üstü multi-mode mikroplaka okuyucu. Akademik ayarları orta-yüksek verimli ekranlar için idealdir. Bu bir multi-kanal pipetter ve makinenin bir defada bir çok floresan reaktiflerin floresan değişiklikleri izlemek için bir sütun okur ile donatılmış entegre bir sıvı aktarım modülü vardır. Örneğin, FlexStation 3 Ca 2 + geçirgen iyon kanalları ve G-protein reseptörler hücre içi serbest Ca 2 + düzeyleri değişiklikleri ölçerek işlevini incelemek için kullanılmıştır. Geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalları, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynamaktadır seçici olmayan katyon kanalları büyük bir aileyiz. TRP kanalları çoğu kalsiyum geçirgen ve etkinleştirme sırasında kalsiyum akını neden. Bu video, TRPA1 kanal, çok sayıda Ağrılı uyaranlara için bir moleküler sensör farmakolojik profil çalışma FlexStation 3 uygulama göstermektedir. Geçici ya da stabil bir şekilde 96-kuyucuğu yetişen insan TRPA1 kanal, ifade HEK293 hücreleri floresan boya + duyarlı Ca 2, Fluo-4, ve bu hücrelerin gerçek zamanlı floresan değişiklikler ile yüklenen uygulama öncesi ve sırasında ölçülen FlexStation 3 FLEX modunu kullanarak bir TRPA1 agonist. Varsayılan TRPA1 antagonisti etkisi de incelenmiştir. Veri SoftMax Pro yazılımı TRPA1 aktivatörleri ve inhibitörleri konsantrasyon-yanıt ilişkileri oluşturmak için transfer edilir.

Bu video FlexStation 3 kullanarak insan TRPA1 kanalları farmakolojik profili çalışmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Protokol hücre hazırlama, boya yükleme ve mikroplaka okuyucu, FlexStation 3 operasyon detayları kapsar.

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

Molecular Devices' FlexStation 3, çok kuyucuklu plakalarda otomatik floresan ölçümü yapabilen, tezgah üstü, çok modlu bir mikroplaka okuyucusudur. O...

Bu prosedürün genel amacı, geçici reseptör potansiyeli veya TRPA1 kanalının farmakolojik profilini incelemek için Flex Station three uygulamasını göstermektir. Bu, öncelikle 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarında TRPA1 kanallarını eksprese eden hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir.Hücreler bir mikroplaka yıkayıcıda yıkandıktan sonra, kalsiyuma duyarlı floresan boya ile yüklenir. Hücre yükleme süresinin ardından birkaç ek yıkama işlemi gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, bir TRIP-1 agonisti ve olası bir TRIP-1 antagonistini içeren bileşik plakasını hazırlamaktır.Son adım olarak, Flex Station three sisteminde plaka okuma için yazılım parametreleri ayarlanır. Nihayetinde, flu phonemic acid ile trip A one aktivasyonu ve antagonist bileşik A ile inhibisyonu için doz yanıt ilişkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, kalsiyum girişini ölçerek 21 aktivasyon mekanizmaları hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, kalsiyuma duyarlı frozen boyalar veya maly potansiyel boyalar kullanılarak diğer kalsiyum geçirgen eye kanallarının ve deep protein coupled reseptörlerinin fonksiyonlarını incelemek için de uygulanabilir.Bu Taktiğin, kalsiyum görüntüleme ve manuel yama haritalama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu zaman tasarrufu sağlayan tekniğin kalsiyum formülü, demir kanalları ve diğer ca mobilize edici reseptörlerin fonksiyonu ve modülasyonu için yüksek kapasiteli tarama sağlamasıdır. Bu protokole başlamadan önce, yazılı protokolde açıklandığı üzere, trip A one ile stabil olarak transfekte edilmiş HEC 2 93 hücrelerini %70 ila %90 yoğunluğa ulaşana kadar büyütün. Kalsiyum deneyi için hücre hazırlığına başlamak üzere, her bir kuyucuğa 50 µL poli-L-ornitin pipetleyerek 96 kuyucuklu plakaları kaplayın ve plakaları 37 °C'de en az 15 dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından hücreleri bir kez KO'nun fosfat tamponlu salini ile yıkayın. Tripsin işleminden sonra, HEC 2 93 hücrelerinden istenen miktarı 15 mililitrelik steril konik tabanlı bir tüpe aktarın ve örneği santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve oluşan hücre peletini yeniden süspande edin.%10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovine serum ile takviye edilmiş DMEM kültür ortamı içerisinde, 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 100 µL hücre süspansiyonu dağıtın. Çok kanallı pipet kullanarak, plakayı nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörüne 20 ila 44 saat süreyle yerleştirmeden önce, steril kabin içerisinde en az 30 dakika bekletin. Kalsiyum analizi hazırlığı için öncelikle yazılı protokolde açıklandığı şekilde çözeltileri hazırlayın.Hazırlandıktan sonra, 1 mM flu oh 4:00 AM'den 10 µL ile onic. F1 27'den 10 µL karıştırın, tüm içeriği %0,1 sığır serum albumin eklenmiş 5 mL flu. oh dört analiz tamponuna aktarın.Ardından, 96 kuyucuklu plakalarda büyütülen hücreleri, bir mikroplaka yıkama cihazı kullanarak kuyucuk başına 80 µL HBSS ile iki kez yıkayın. Yıkama işleminin ardından, çok kanallı bir pipet yardımıyla kuyucuk başına 50 µL Fluo-4 yükleme çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bir saatlik hücre yükleme süresi boyunca, agonistlerin üç katı (3x) konsantrasyonundaki çözeltilerinden oluşan bir seri, antagonistlerin üç katı (3x) konsantrasyonundaki çözeltilerinden oluşan bir seri ve Fluo-4 analiz tamponu içerisinde 300 µM agonist içeren yüksek hacimli bir stok hazırlayın.Seyreltilmiş bileşik çözeltilerinden 300 µL'yi 96 kuyucuklu bir bileşik plakasına aktarın. Mümkün olduğunca, bir bileşiğin seri seyreltmesi ile buna karşılık gelen pozitif ve negatif kontrollerin bileşik plakasının aynı sütununda yer almasını sağlayın. Flex station three her seferinde tek bir sütun okuduğundan, son hücre hazırlama adımı olarak, antagonist içeren her kuyucuğun yanına 300 µM agonist çözeltisinden 300 µL pipetleyin.Yüklü hücreleri, mikroplaka yıkayıcıyı kullanarak flu oh four asit tamponu ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra her kuyucukta 80 µL flu oh four asit tamponu bırakın. Plaka okumaya başlamak için Flex Station three sistemini açın ve soft max Pro 5.2 yazılımını çalıştırın.Deneyi kurulum aşamasında yeni bir dosya adıyla kaydedin. Flex modu seçin ve yazılı prosedürde listelendiği üzere agonist ve antagonist etkilerini ölçmek için parametreleri girin. Ardından, yeni bir uç kutusunu, bileşik plakasını ve okuma plakasını flex istasyonunun uygun tepsilerine yerleştirin. Üç.Soft Max Pro yazılımındaki okuma düğmesine tıklayarak plaka okuma işlemini başlatın. Flex Station three, her seferinde bir sütunu okuyacak ve okumayı kesintiye uğratmadan önceden programlanmış zaman noktalarında bileşikleri ekleyecektir. Çalışma tamamlandığında, deneysel veriler doğrudan Soft Max PRO yazılımı kullanılarak işlenebilir veya Microsoft Excel gibi herhangi bir hesap tablosu programına kopyalanıp yapıştırılabilir.Verileri analiz etmek için, yazılı prosedürde açıklandığı üzere en küçük kareler uydurma yöntemini kullanarak TRPA1 agonisti olan fluphenamic acid ve putative TRPA1 antagonisti olan bileşik A için konsantrasyon yanıt eğrileri oluşturun. TRPA1, aktivasyonu kalsiyuma duyarlı boya Fluo-4AM ile tespit edilebilen kalsiyum girişine yol açan, kalsiyum geçirgen bir katyon kanalıdır. Bir dizi fluphenamic acid veya FFA konsantrasyonuna yanıt olarak floresan değişimlerinin zaman seyirlerine ait temsili izler, yüksek konsantrasyonlarda gösterilmiştir. Benzer pik floresan seviyelerine rağmen, FFA tarafından tetiklenen floresan artışı, düşük konsantrasyonlara göre çok daha hızlı bir kinetik sergiler.Bu farkları ayırt etmek için, floresans artışının başlangıç hızları ölçülerek konsantrasyon yanıt ilişkisi oluşturulmuştur. Farklı FFA konsantrasyonlarının eklenmesiyle, FFA'nın yarı maksimal etkili konsantrasyonu 55.4 micromolar olarak belirlenmiştir. Muhtemel bir trip a one antagonisti olan bileşik A tarafından FFA kaynaklı kalsiyum yanıtının inhibisyonuna dair konsantrasyon yanıt ilişkisi de gösterilmiştir.Bir doz, trip A one hücrelerinin FFA'ya verdiği yanıtı 4,3 micromolar yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu ile bağımsız olarak azaltmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, flag station three kullanarak triple A one ve ilgili kanalların farmakolojik profillerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Içe doğru doğrultucu potasyum (Kir), yüksek verim Bileşik elemesi için kanal aktivitesini ölçmek için nicel bir floresan deneyi geliştirilmesi ve doğrulanması için yöntemler sunulmaktadır.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

MRGPRX2 reseptörü ile mast hücrelerini aktive edebilecek kısa peptitlerden oluşan bir kütüphane oluşturma teknikleri açıklanmıştır. İlişkili teknikler kolay, ucuzdur ve diğer hücre reseptörlerine genişletilebilir.

Tasarlanmış HEK Hücrelerini Kullanarak MRGPRX2'i Etkinleştiren Peptitlerin Taranır

Mevcut protokol, yüksek verimli ilaç taraması ve toksisite testi için iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerde (iPSC-CM'ler) tetiklenen hücresel aktivitenin tüm optik kontrolünü ve gözlemini açıklamaktadır. Zaman ve uzaydaki fenotipik kalıpların multi-parametrik nicelleştirilmesi gösterilmiştir. İlaçların saatler boyunca uzun vadeli etkileri veya günler boyunca sıralı ölçümler gösterilmiştir.

Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

İyon kanallarının farmakolojik olarak hedeflenmesi, solid tümörlerin tedavisinde umut verici bir yaklaşımdır. Kanser hücrelerinde iyon kanalı fonksiyonunu karakterize etmek ve iyon kanalı modülatörlerinin kanser canlılığı üzerindeki etkilerini test etmek için ayrıntılı protokoller sağlanmıştır.

Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Öğrenin, FlexStation 3 kullanarak TRPA1 kanallarının farmakolojik profillerini yüksek verimli kalsiyum testiyle nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, ağrı mekanizmaları ve ilaç geliştirme araştırmaları için değerlidir.

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

Daha fazla video keşfet