FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

Bu prosedürün genel amacı, geçici reseptör potansiyelinin farmakolojik profilini incelemek veya bir kanalı açmak için Flex Station üç'ün uygulamasını göstermektir. Bu, önce 96'da bir kanal açma eksprese eden hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Peki mikrotitre plakaları.

Hücreleri bir mikroplaka yıkayıcıda yıkadıktan sonra, hücrelere kalsiyuma duyarlı floresan boya yüklenir. Grip, oh 04:00'te bir hücre yükleme periyodu daha sonra birkaç ek yıkama ile takip edilir. Prosedürün bir sonraki adımı, bir açma, bir agonist ve bir varsayılan açma, bir antagonist dahil olmak üzere bileşik plakayı hazırlamaktır.

Son adım olarak, yazılım parametreleri Flex Station three sisteminde plaka okuma için ayarlanır. Sonuç olarak, trip A için doz yanıt ilişkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir, ancak grip fonemik asidi ile bir aktivasyon ve antagonist bileşik A tarafından inhibisyon Bu yöntem, kalsiyum akışını ölçerek 21 aktivasyon mekanizması hakkında fikir verebilir. Kalsiyuma duyarlı donmuş boyalar veya maly potansiyel boyalar kullanılarak diğer kalsiyum geçirgen göz kanallarının ve derin protein bağlantılı reseptörlerin fonksiyonlarını incelemek için de uygulanabilir.

Bu Taktiğin kalsiyum görüntüleme ve manuel yama haritalama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu zaman kazandıran tekniğin, kalsiyum formülünün, demir kanallarının ve diğer ca mobilize edici reseptörlerin işlevi ve modülasyonu için yüksek verimli tarama sağlamasıdır. Bu protokolün başlamasından önce, yazılı protokolde açıklandığı gibi% 70 ila 90'lık bir yoğunluğa kadar trip A ile stabil bir şekilde transfekte edilmiş HEC 2 93 hücrelerini büyütün. Kalsiyum tahlili için hücre hazırlığına başlamak için, her bir kuyucuğa 50 mikrolitre poli L ornitin pipetleyerek 96 kuyulu plakayı kaplayın, plakaları 37 santigrat derecede en az 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücreleri KO'nun fosfat tamponlu salin ile bir kez durulayın Tripsin sonrasında, HEC 2 93 hücreleri istenen miktarda hücreyi 15 mililitrelik steril konik tabanlı bir tüpe ve santrifüje aktarır. Örnek. Süpernatanı çıkarın ve elde edilen hücre peletini yeniden süspanse edin.

% 10 ısı ile takviye edilmiş DMEM kültür ortamında, inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtır. Çok kanallı bir pipetleyici kullanarak, plakayı 20 ila 44 saat boyunca nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörüne yerleştirmeden önce en az 30 dakika kaputta bekletin. Kalsiyum tahlili hazırlığı için önce yazılı protokolde tarif edildiği gibi çözeltileri hazırlayın.

Hazırlandıktan sonra, 10 mikrolitre bir milimolar grip oh 04:00'te 10 mikrolitre onik ile karıştırın. F1 27, tüm içeriği beş mililitre gribe aktarın. Oh, %0.1 sığır serum albümini ile desteklenmiş dört tahlil tamponu.

Daha sonra, 96 yılında büyüyen hücreleri yıkayın. Kuyu başına 80 mikrolitrede HBSS'li kuyu plakaları, yıkamadan sonra bir mikroplaka yıkayıcı kullanarak iki kez, çok kanallı bir pipetleyici ile kuyu başına 50 mikrolitrede grip oh 04:00 yükleme solüsyonunu ekleyin ve plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir saatlik hücre yükleme periyodu boyunca, bir dizi üç x agonist çözeltisi, bir dizi üç x antagonist çözeltisi ve grip oh dört tahlil tampon pipetinde büyük miktarda 300 mikromolar agonist hazırlayın.

300 mikrolitre seyreltilmiş bileşik çözelti, 96 kuyulu bir bileşik plakaya. Bir bileşiğin seri seyreltmesini ve karşılık gelen pozitif ve negatif kontrolleri, mümkün olduğunda bileşik plakanın aynı sütununda olacak şekilde düzenleyin. Flex istasyonu üç, her seferinde tek bir sütunu okurken, daha sonra son hücre hazırlama adımı olarak antagonisti içeren her bir oyuğa bitişik 300 mikromolar agonist solüsyonunun 300 mikrolitresini pipetleyin.

Son yıkamadan sonra mikroplaka yıkayıcıyı kullanarak yüklü hücreleri grip oh dört asit tamponu ile üç kez yıkayın. Her kuyucuğa 80 mikrolitre grip oh dört asit tamponu bırakın. Plaka okumaya başlamak için Flex Station three sistemini açın ve soft max Pro 5.2 yazılımını açın.

Denemeyi kurulumda yeni bir dosya adıyla kaydedin. Esnek modu seçin ve yazılı prosedürde listelendiği gibi agonist ve antagonist etkisini ölçmek için parametreleri girin. Ardından, esnek istasyonun uygun tepsilerine yeni bir uç kutusu, bileşik plaka ve okuma plakası yerleştirin. Üç.

Soft Max Pro yazılımındaki oku düğmesine tıklayarak plaka okumaya başlayın. Flex Station üç, her seferinde bir sütunu okuyacak ve okumayı kesintiye uğratmadan önceden programlanmış zaman noktalarında bileşikler ekleyecektir. Çalışma tamamlandıktan sonra, deneysel veriler doğrudan Soft Max PRO yazılımı kullanılarak işlenebilir veya Microsoft Excel gibi herhangi bir elektronik tablo programına kopyalanıp yapıştırılabilir.

Verileri analiz etmek için, yolculuk için konsantrasyon yanıt eğrileri, bir agonist grip fonemik asidi ve varsayılan yolculuk için yazılı prosedür gezisinde açıklandığı gibi en az kareler kullanarak bir antagonist bileşik a oluşturun. Bunlardan biri, aktivasyonu kalsiyuma duyarlı boya gribi oh 4:00 tarafından tespit edilebilen kalsiyum akışına yol açan kalsiyum geçirgen bir katyon kanalıdır. Bir dizi grip fonemik asidi veya FFA konsantrasyonuna yanıt olarak floresan değişikliklerine kadar geçen sürenin temsili izleri daha yüksek konsantrasyonlarda gösterilir. FFA uyarılmış floresan, benzer tepe floresan seviyelerine rağmen, daha düşük konsantrasyonlara göre çok daha hızlı bir kinetik ile artar.

Bu farklılıkları ayırt etmek için, floresan artışının başlangıç oranları ölçülerek konsantrasyon tepkisi ilişkisi oluşturulmuştur. Farklı FFA konsantrasyonlarının eklenmesi üzerine, FFA'nın yarı maksimal etkili konsantrasyonu 55.4 mikromolar olarak belirlendi. FFA'nın inhibisyonunun konsantrasyon tepkisi ilişkisi, bir antagonist bileşik olan A'nın varsayılan bir gezi ile uyarılmış kalsiyum tepkisi de bileşik olarak gösterilmiştir.

Bir doz, 4.3 mikromolar yarı maksimal inhibitör konsantrasyon ile trip A tek hücrelerinin FFA'ya tepkisini bağımsız olarak azalttı. Bu videoyu izledikten sonra, üçlü A ve ilgili kanalların farmakolojik profillerini üç bayrak istasyonu kullanarak nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.