JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:11 dk • April 28th, 2025
Elektron mikroskobu ızgarasında bir fare retina kesiti alın. Bölüm, bipolar hücrelere sinaptik olarak bağlı retinal ganglion hücrelerini veya RGC'leri içerir.
Presinaptik bipolar hücreler, sinaptik zarın yakınında bir şerit yapısında düzenlenmiş nörotransmitter vezikülleri içerir.
Postsinaptik RGC'ler, zarlarında kümelenmiş nörotransmitter reseptörleri gösterir. Bu hücreler kolera toksini alt birimi B veya CTB ile etiketlenir.
PH'ı korumak için bir tamponla yıkayın.
Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için bir engelleme tamponu ile inkübe edin.
Nörotransmitter reseptörlerini ve CTB'yi hedef alan primer antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak ve pH'ı korumak için bir tamponla yıkayın.
Birincil antikorlara bağlanan ve hedef molekülleri etiketleyen farklı boyutlardaki altın nanopartiküllere konjuge edilmiş ikincil antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarın, ardından numuneyi havayla kurutun.
Makromolekülleri bağlayan ve kontrastı artıran ağır metaller uygulayın.
Elektron mikroskobu kullanarak, etiketli CTB'leri kullanarak RGC'leri tanımlayın ve etiketli nörotransmitter reseptörlerini bulun.
Bu adımda, 70 nanometre kalınlığında, ultra ince kesitleri bir ultramikrotom ile kesin ve bunları Formvar-karbon kaplı nikel ızgaralarda toplayın. Izgaraları bir kez damıtılmış suda yıkayın, ardından üç kez TBS yıkayın. Daha sonra, ızgaraları TBS'de 20 mikrolitre% 5 BSA'da 30 dakika inkübe edin ve daha sonra 20 mikrolitre keçi anti-CTB ve oda sıcaklığında gece boyunca bir NMDAR alt birimine karşı bir antikor içeren bir karışımda inkübe edin.
Bundan sonra, ızgaraları her seferinde pH 7.6'da 20 mikrolitre TBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, ızgaraları bir kez TBS ile pH 8.2'de beş dakika boyunca yıkayın. Izgaraları, 10 nanometre altın parçacıklarına bağlı eşek anti-tavşan IgG ve 18 nanometre altın parçacıklarına bağlı eşek anti-keçi IgG içeren bir karışımın 20 mikrolitresi ile iki saat boyunca inkübe edin.
İki saat sonra, ızgaraları pH 7.6'da 20 mikrolitre TBS'de üç kez yıkayın, ardından ultra saf suda yıkayın. Ve sonra ızgaraları havayla kurutun. Daha sonra, ızgaraları damıtılmış suda sekiz dakika boyunca% 5 uranil asetat ile karşı boyayın, ardından karanlıkta beş dakika boyunca damıtılmış suda% 0.3 kurşun sitrat ile karşı boyayın.