JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:52 dk. • April 28th, 2025
Lüminesan bir substrat olan lusiferin ile desteklenmiş bir stimülasyon çözeltisinde yapışık rekombinant memeli hücreleri içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.
Luciferin'in hücreye girmesine izin vermek için kuluçkaya yatırın.
Bu hücreler, koku alma G-proteinleri ve reseptör taşıma proteinleri ile birleştirilmiş zara bağlı koku reseptörlerini eksprese eder.
Ek olarak, hücreler sitoplazmik Glosensor proteinlerini, döngüsel AMP'ye duyarlı ışıldayan proteinleri eksprese eder.
Kuyucuklar arasındaki boşluğa buharlaşabilir bir koku çözeltisi ekleyin ve plakayı aynı koku verici madde ile önceden dengelenmiş bir luminometre aletinin içine yerleştirin.
Lüminesans ölçümünü başlat.
Koku molekülleri, hücrelerin koku reseptörlerine bağlanır, birleştirilmiş G-proteinini aktive eder ve G-proteininin α alt birimini veya Gα'yı ayrıştırır.
Ayrışmış Gα alt birimi, zara gömülü adenilat siklaz enzimine bağlanarak onu aktive eder. Aktive edilmiş enzim, ATP'leri döngüsel AMP'lere dönüştürür.
Bu döngüsel AMP'ler, glosensör proteinlerine bağlanarak konformasyonlarını değiştirir ve lusiferin bağlanmasını sağlar.
Bu etkileşim, koku reseptörlerinin aktivasyonunu doğrulayarak lüminesans üretir.
75 mikrolitre cAMP reaktif çözeltisi ekleyin. Stimülasyon solüsyonunu kuyucuklardan çıkarın ve her oyuğa 25 mikrolitre seyreltilmiş cAMP reaktif solüsyonu ekleyin. 96 oyuklu plakayı oda sıcaklığında karanlık ve kokusuz bir ortamda iki saat inkübe edin.
İlk olarak, kokulu asetofenonu 10 mililitre mineral yağda% 1'e seyreltin ve tüpü kapatın. cAMP reaktif inkübasyon süresinin bitiminden önce, 96 oyuklu yeni bir plakada her bir oyuğa 25 mikrolitre koku verici solüsyon ekleyin. Ardından, odayı uçucu koku molekülleri ile dengelemek için bu koku plakasını luminometre odasına beş dakika boyunca yerleştirin. Luminometreyi, döngüler arasında 0,7 saniyelik aralıkla 20 döngü 90 saniyelik plaka ölçümü sırasında sıfır saniye gecikmeyle lüminesansı kaydedecek şekilde ayarlayın.
Plakayı okumadan hemen önce, koku plakasını hazneden çıkarın. Kopyalanan hücreleri içeren 96 oyuklu plakada, oyuklar arasındaki boşluğa 25 mikrolitre koku verici ekleyin ve plakayı hızlı bir şekilde odaya geri koyun. 30 dakika içinde 20 döngü için tüm kuyucukların lüminesans ölçümünü başlatın.