JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:01 dk. • April 28th, 2025
Anestezi uygulanmış bir kontrol faresi ve lazerle indüklenen beyin hasarı faresi modelini ele alalım.
Sağ hemisfere yapılan lazer uygulaması, hücrelere ve kan-beyin bariyerine veya kanı beyin dokusundan ayıran BBB'ye zarar verdi.
Beyne ulaşmak için sistemik dolaşımdan geçen kanüllü kuyruk damarına bir izleme boyası enjekte edin.
Boya plazma proteinlerine bağlanır ve hasarlı BBB yoluyla beyin dokusuna sızar.
Farelere ötenazi yapın.
Boyayı dolaşımdan temizlemek için fareleri kalbin içinden geçirin.
Beyni ayıklayın ve dilimleyin, dilimleri yaralı yarımküreden ayırın ve homojenize edin.
Proteinleri denatüre etmek için asidik bir çözelti ile muamele edin ve proteine bağlı boyayı serbest bırakın.
Boya içeren süpernatantı santrifüjleyin ve izole edin. Boya floresansını arttırmak için alkol ekleyin.
Solüsyonu bir mikro plakaya aktarın. Uyarılma üzerine, yaralı beyinde daha yüksek bir floresan yoğunluğu, lazerin neden olduğu BBB hasarını gösterir.
Kan-beyin bariyeri kırılma insidansını değerlendirmek için, lazerin neden olduğu yaralanmadan 24 saat sonra, kilogram salin çözeltisi başına 4 mililitre içinde seyreltilmiş% 2 Evans mavisi boya içeren bir şırınga yükleyin ve çözeltiyi kanüllü kuyruk damarı yoluyla yaralı ve kontrol farelerine intravenöz olarak verin.
İlk hayvanın göğsünü açmak için cerrahi pim setleri ve makas kullanmadan önce çözeltinin bir saat dolaşmasına izin verin. Sağ atriyumdan renksiz bir perfüzyon sıvısı görülene kadar, sol ventrikül yoluyla 110 milimetre cıva basıncında soğutulmuş% 0.9 salin ile açıkta kalan kalbi perfüze edin.
Sonra, beyni hasat edin ve 2 milimetre rostrokaudal dilimler elde edin. Yaralı ve yaralı olmayan hemisferlerin ayrı ayrı değerlendirilmesini sağlamak için sol beyin dilimlerini sağ beyin dilimlerinden ayırın ve örnekleri tartın. Numuneleri bir havan ve havan tokmağı kullanarak homojenize edin ve doku numunelerini 24 saat boyunca %50 trikloroasetik asit içinde inkübe edin.
Ertesi gün, homojenize beyin dokusu örnekleri 10.000 kez g ve oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj edildi. 1 mililitre süpernatanı 1.5 mililitre% 96 etanol ile 1 ila 3 oranında karıştırın. Ardından, kan-beyin bariyeri kırılmasını değerlendirmek için 620 nanometre uyarma ve 680 nanometre emisyon dalga boyunda bir floresan dedektörü kullanın.