Endotel Hücrelerinde Sıkı Bağlantı Proteinlerinin ve Stres Liflerinin Floresan Lokalizasyonu

Kan-beyin bariyerinin endotel hücre tabakasını taklit eden, sıçan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinin veya RBMEC'lerin tek katmanlı kültürünü içeren odacıklı bir slayt alın.

Hücreler, oksijen-glikoz yoksunluğundan ve ardından reoksijenasyondan kaynaklanan stres nedeniyle bozulmuş sıkı bağlantı proteinleri ve aktin stres lifleri sergiler.

Ortamı çıkarın ve hücreleri yıkayın, hücre mimarisini korumak için bir fiksatif uygulayın, ardından fazla fiksatifi yıkayın.

Hücresel zarları geçirgen hale getirmek için bir deterjanla tedavi edin.

Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için bir engelleme maddesiyle inkübe edin.

Sıkı bağlantı proteinlerini etiketlemek için, spesifik birincil antikorlarla inkübe edin, ardından bağlanmamış antikorları çıkarın.

Primer antikorları etiketlemek için florofor konjuge ikincil antikorlarla inkübe edin.

Alternatif olarak, stres liflerini etiketlemek için florofor etiketli falloidin ekleyin.

Bağlanmamış etiketleme moleküllerini çıkarmak için yıkayın.

Hazneyi çıkarın, çekirdekleri boyamak için floresan DNA bağlayıcı boya içeren bir montaj ortamı uygulayın, ardından bir lamel ile kapatın.

Konfokal mikroskopi kullanarak, floresanla etiketlenmiş sıkı bağlantı proteinlerini ve stres liflerini görselleştirin.

RBMEC tek katmanlarının her bir kuyusunu 100 ila 200 mikrolitre Opti-MEM azaltılmış serum ortamına maruz bırakarak başlayın ve inkübasyonlarına bir saat boyunca devam edin. Ardından, yıkama başına oyuk başına 100 ila 200 mikrolitre PBS kullanarak hazne slaytlarını üç kez yıkayın. Hücreleri PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve slaytları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ve hücreleri daha önce olduğu gibi PBS ile üç kez yıkayın.

Şimdi, her bir oyuğa PBS'de 100 ila 200 mikrolitre% 0.5 Triton X-100 uygulayarak hücrelere nüfuz edin. Ve plakanın oda sıcaklığında 15 dakika daha inkübe edilmesine izin verin. Hücreler geçirgen hale geldikten sonra, bloke edici çözeltiyi uygulayın. Ve bunun oda sıcaklığında bir saat boyunca hücreler üzerinde etkili olmasına izin verin.

Daha sonra, ya ZO-1 proteini için immünofloresan yapın ya da F-aktin etiketleyin. Hücrelerin ZO-1 için immünofloresan yapmasını sağlamak için, bunları gece boyunca 4 santigrat derecede birincil antikorla inkübe edin. Ertesi gün, sabitleyiciyi çıkarırken olduğu gibi hücreleri PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri 100 ila 200 mikrolitre FITC etiketli tavşan önleyici ikincil antikor içinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve hücreleri rodamin falloidin ile etiketleyin.

Bloke edici çözeltiyi bir saat boyunca uyguladıktan sonra, hücreleri 1 ila 50 seyreltmede 100 ila 200 mikrolitre rodamin phalloidine maruz bırakın, 20 dakika boyunca% 2 BSA PBS ile. İkincil antikor veya rodamin phalloidin inkübasyonundan sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi üç kez PBS ile yıkayın. Ardından elastiki soyarak hazneleri çıkarın. Antifade ve DAPI içeren ortamı kullanarak slaytları monte etmeye devam edin. Konfokal mikroskopi ile hücreleri 60x objektif ile tek bir düzlemde görüntüleyin.