$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Kimyasal olarak sabitlenmiş bir insan olmayan primat beyin bölümü ile başlayın.
Aldehit bazlı fiksatif, doku yapısını koruyarak proteinleri çapraz bağlar, ancak bazı reaktif aldehit kalıntıları bırakır.
Doku bölümünü çevreleyen kriyoprotektan tabakayı çıkarmak için yıkayın.
Reaktif aldehit gruplarını nötralize etmek için bir indirgeyici ajan ekleyin ve reaksiyon yan ürünleri üretin.
Bu yan ürünleri ve fazla azaltıcı maddeleri çıkarmak için yıkayın.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için bir bloke edici solüsyon uygulayın.
Nöronal membran üzerindeki belirli bölgelerde eksprese edilen bir proteini hedefleyen birincil antikorları ekleyin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.
Birincil antikorları hedef alan biyotinile ikincil antikorlar ekleyin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.
İkincil antikorlara bağlanan avidin-biotin-peroksidaz kompleksleri ile kaplama.
Bağlanmamış kompleksleri çıkarmak için tekrar yıkayın.
Hidrojen peroksit ile birlikte kromojenik bir substrat ekleyin. Hidrojen peroksit varlığında, peroksidaz enzimi substratı oksitleyerek kahverengi çökeltiler oluşturur.
İlgilenilen bölgeyi içeren 50 mikron kalınlığındaki akrolein sabit insan olmayan primat beyninin bölümlerini PBS içeren 12 oyuklu bir plakaya aktararak başlayın. Serbest yüzen bölümleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra bölümleri taze hazırlanmış sodyum borhidrür çözeltisinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kapaksız nazikçe sallayın.
30 dakika geçtikten sonra, sodyum borhidrürü aspire edin ve her bir oyuğa PBS ekleyin. Plakayı bir külbütörün üzerine yerleştirin ve 10 dakika kuvvetlice çalkalayın. Yıkamayı iki kez daha veya reaksiyon gazının hiçbiri kalmayana kadar tekrarlayın. % 2 normal serum ve% 0.5 soğuk balık jelatini çözeltisi içinde inkübe ederek, PBS'de oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallanarak bölümleri bloke edin.
İnkübasyon süresi geçtikten sonra, bölümleri ve birincil antikor solüsyonunu gece boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallayarak inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, bölümleri ikincil antikor çözeltisi içinde oda sıcaklığında 1.5 saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Bölümleri daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, avidin biotin peroksidaz veya ABC çözeltisinde bir saat boyunca sallanarak inkübe edin.
Daha sonra, TBS'de seyreltilmiş% 0.05 hidrojen peroksit ile% 0.05 3,3-diaminobenzidin içeren taze bir çözelti hazırlayın. Yıkadıktan sonra, DAB çözeltisindeki bölümleri hafifçe sallayarak üç ila yedi dakika inkübe edin. Kahverengi çökelti istenen renge dönüştüğünde, soğuk TBS'de iki kez hızlı bir şekilde yıkayarak, ardından bir dizi zamanlanmış TBS ve PB yıkaması yaparak reaksiyonu durdurun.