JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:36 dk. • April 28th, 2025
Beyin tümörü nörosferlerinin parafine gömülü bölümleri, tümöre özgü nükleer protein biyobelirteçleri sergileyen nöral kök hücre kümeleri ile bir slayt alın.
Parafini eritmek için ısıtın, ksilen kullanarak çıkarın ve azalan alkol konsantrasyonlarını kullanarak dokuyu yeniden sulandırın.
Biyobelirteçler üzerindeki epitopları maskelemek ve hücresel zarları geçirgen hale getirmek için deterjan içeren asidik bir tamponda ısıtın.
Durulayın, ardından endojen peroksidaz enzimlerini etkisiz hale getirmek için oksitleyici bir ajanla işlemden geçirin ve spesifik olmayan sinyalleri önleyin.
Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini maskelemek için bir engelleme çözümü uygulayın.
Biyobelirteç epitoplarını hedef alan primer antikorlarla inkübe edin.
Durulayın, ardından birincil antikorlara bağlanan biyotin konjuge ikincil antikorlarla tedavi edin.
Biotin'e bağlanan peroksidaz enzimi ile konjuge avidin ile durulayın ve inkübe edin.
Bir kromojenik substrat ve bir oksitleyici ajan ekleyin.
Peroksidaz, substratı renkli çökeltilere dönüştürmek için ajanı kullanır ve biyobelirteç konumunu etiketler.
Çekirdekleri karşı boyayın, dokuyu alkolde kurutun ve biyobelirteç dağılımını görüntülemek için slaydı monte edin.
İlk olarak, slaytları metal bir rafta 60 santigrat derecede 20 dakika inkübe ederek parafini eritin. Daha sonra slaytları Tex protokolüne göre oda sıcaklığında bir rehidrasyon treninde inkübasyon yoluyla deparafinize etti. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için slaytları musluk suyunda saklayın. Bundan sonra, slaytları sitrat tamponunda 125 santigrat derecede 30 saniye, 90 derecede 10 saniye inkübe edin. Damıtılmış suyla beş kez durulamadan önce slaytları soğumaya bırakın.
Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında% 0.3 hidrojen peroksit içinde 20 dakika inkübe edin. Ardından, slaytları hafif çalkalama ile yıkama tamponunda üç kez beş dakika yıkayın. Slaytları, seyreltilmiş birincil antikor ile 4 santigrat dereceye ayarlanmış nemlendirilmiş bir odada gece boyunca inkübe edin. Bundan sonra, slaytları hafifçe çalkalayarak beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
Daha sonra, slaytları seyreltilmiş biyotinile edilmiş ikincil antikorda oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Slaytları yıkama tamponunda beş dakika boyunca üç kez hafif çalkalayarak yıkayın. Daha sonra, slaytları avidin biyotinile yaban turpu peroksidaz kompleksinde oda sıcaklığında karanlıkta bir saat inkübe edin. Yıkamayı daha önce tarif edildiği gibi tekrarlayın. Bundan sonra, slaytları oda sıcaklığında iki ila beş dakika boyunca dab hidrojen peroksit substrat bantları ile inkübe edin.
Slaytları musluk suyuyla durulayın ve slaytları lekelemek için hematoksilen çözeltisine batırın. Ardından, su berraklaşana kadar slaytları musluk suyunda iyice durulayın. Slaytları Tex protokolüne göre kurutun. Son olarak, slaytları ksilen bazlı bir montaj ortamı ile örtün ve oda sıcaklığında düz bir yüzeyde kurumaya bırakın.