Name: Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Öğrenin, enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirüs nükleokapsit DNA'sı izolasyonu için ultrasantrifüjasyon ve fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak viroloji araştırmalarında yüksek verimli dizileme ve transfeksiyon uygulamaları için ideal saflıkta viral DNA elde etme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarları Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, Enquist laboratuvar ince ayar bu protokol üyeleri ve katkıları için teşekkür ederiz.

1. İlk Gün: Viral Enfeksiyon ve Tamponlar hazırlanması <ol><li> Doku kültürü enfeksiyon hücreleri 5-10 yemekleri hazırlayın (15 cm çapında), örneğin pseudorabies virüs (PRV) veya herpes Vero hücreleri PK-15 hücreleri virüs simpleks (HSV). </li><li> Hücreleri 95 -% 100 birleşmiş, bir (İçişleri Bakanlığı) 5-10 onları bozar. Bunu yapmak için, plaka, plaka başına 4 ml toplam hacmi virüs stok kullanılarak her aşılamak, daha sonra 37 tabak az 1 saat inkübe ° C Rock plates yavaşça her 15 dakikada bir hücre tek tabaka virüs inokulum tarafından tamamen kaplı kalmasını sağlamak için. Bu arada, bir sonraki adım için ortam sıcak. </li><li> Bir saat sonra enfeksiyon, viral inokulum plakalardan aspire 15 ml sıcak orta ekleyin ve 37 ° C'de 12-20 saat süreyle nemlendirilmiş bir inkübatör. </li><li> LCM tamponlar (bkz. Tablo 1) ve geceleme kaya 4 ° C tam karıştırma için hazırlayın. (Bkz. Tablo 2) viral DNA tabanda için TNE hazırlayın. </li></ol> 2. İkinci Gün, 1. Aşama: Hücre Lizis ve Ultrasantrifügasyon <ol><li> Görme hücre enfeksiyon tekdüze sitopatik etki (CPE) neden oldu onaylamak. Tüm hücreleri yuvarlak var, ama plaka kaldırdı kadar enfeksiyon ilerlemeye izin ver. </li><li> Enfekte olmuş hücreleri ortama Pençe ve 50 ml konik tüpler içine hücreleri ve orta birleştirmek. Bu adım için gerekli konik tüpler sayısı yukarıdaki Adım 1.2 enfeksiyon için kullanılan yemekler sayısına bağlı olacaktır, örneğin bir 50 ml konik tüp maksimum 3 yemekler her Opsiyonel 15 ml orta pelet kullanılır: durulayın 10 ml PBS ile plakaları ve hücreleri ve orta ile birleştirir. </li><li> Santrifüj hücreleri ve 2000 oda sıcaklığında göreceli centifugal kuvveti (RCF) 10 dakika orta, sonra supernatant aspirat ve 10 ml PBS her pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Bir viral enfeksiyon pelet Adım 2.2 'de birden fazla konik tüpler içine yayılmış ise, bu adım konik bir tüp içine recombined olabilir. Tekrar santrifüj ve aspirasyon Opsiyonel: Bu pelet -20 ° C'de saklanır ve protokol, daha sonraki bir zamanda devam edilebilir . </li></ol> 3. İkinci Gün, 2. Aşama: Ultrasantrifügasyon Aşağıdaki adımları sırasında hücre pelet ve buz üzerinde LCM tamponlar zaman tutun. <ol><li> 0% gliserol β-mercaptoethanol Ekle - LCM tampon. Ayarlayarak ultrasantrifüjdeki (aşağıda adım 3.9) soğutma başlayın 4 ° C ve vakum açma. </li><li> Uzun clumpy kadar LCM tampon - 0% gliserol 5 ml hücre pelletini tekrar. Gerekirse tüp herhangi bir çözünmemiş hücre pelletini break up, girdap. </li><li> 1.5 ml Freon (1,1,2-trikloro-1 ,2,2-trifluoroethane) ekleyerek ve şiddetle vorteks ayıklayın. Hemen 4 ° C sıcaklıkta 2000 RCF az 10 dakika süreyle santrifüj Geniş çaplı bir pipet (arayüz kaçınarak) ile üst katman toplayın ve yeni bir tüp Opsiyonel transferi: pelet jelatinimsi bir katı ise, yeni bir tüp içine hızlı bir şekilde en üst tabakasını dökmek. </li><li> Freon çıkarma tekrarlayın ve tekrar santrifüj. </li><li> En üst tabakası (~ 5 ml) toplayın ve yeni bir polyallomer ultrasantrifüjdeki tüp transfer. LCM tamponlar kalan iki gliserol β-mercaptoethanol ekleyin. </li><li> LCM (orta tabaka), ve sonra tekrar 2.5 ml% 45 gliserol ile underlaying - - LCM (alt tabaka) 3 ml% 5 gliserol ile Freon ekstraktı (üst tabaka) underlaying polyallomer santrifüj tüpüne bir degrade hazırlayın. Tüp içeriğinin taşma önlemek için ince bir pipet kullanın. </li><li> Gerekirse, LCM tamponlar aynı oranlarda kullanarak eşdeğer bir denge tüp hazırlayın. </li><li> Tüpler ultrasantrifüjdeki kova içine aktarın. LCM tampon üst tabakası (bir kerede ~ 50-100 ul) - hafifçe ekstra% 0 gliserol ekleyerek, 0,1 g birbirlerinin içinde kova Dengesi. </li><li> Yatay veya sallanan bir kova rotor soğuk bir ultrasantrifüjdeki kullanarak, 77,000 RCF (örneğin bir SW41Ti rotor için 25.000 rpm), 4 ° C sıcaklıkta 1 saat süreyle dengeli örnekleri Spin </li><li> Ultrasantrifügasyon sırasında, etanol yağış adım (4.6), kayan DNA yakalamak için bir cam kanca olun. Bir bardak yeniden süspanse her iki ucundan tutun ve bir alev üzerinde orta bölümü askıya. Cam bir bölüm neredeyse erimiş olduğunda, cam germek için nazikçe çekin sıkıca açılı bir kanca (&lt;90 derece) oluşturmak için hafifçe bükün, ve sonunda mühür keskin çekin. Cam, cam kanca ucu açık ise kapatmak için yeterli erir, böylece ateşte ucu tutun. </li><li> Ultrasantrifügasyon sonra, ince bir opak pelet ortasında karanlık bir nokta göreceksiniz. Dikkatle tüpten kenarları boyunca damlayan da dahil olmak üzere sıvı aspire, ancak tüpün alt kısmında pelet kaçınarak. </li><li> Oda sıcaklığında 0,5 ml TNE ekleyin. </li><li> Pelet, pelet hidrasyon sağlamak için en az 10 dakika oturup Optional: 4 tutulması durumunda pelet gecede TNE tekrar süspansiyon ° C </li></ol> 4. Üçüncü Gün: "Ghost" DNA Yağış <ol><li> Küçük çaplı bir pipet ucu (örneğin bir P200 pipet) ile pipetleme pelet kadar Break . Viral DNA, hala bu noktada capsids bulunan olduğundan, bu aşamada kesme hakkında endişelenmeyin. Capsids yok oda sıcaklığında viral pelet, içeren tüp aşağıdaki reaktifler ekleyin: <ul><li> 4.25 ml TNE </li><li> 0.25 ml% 10 SDS </li><li> 2 mg Proteinaz K </li></ul> Bu reaktifler karıştırmak için yavaşça sallayın. Viskozite hafif bir artış olmalıdır. </li></ol> Burada kesme dikkat edin, örneğin büyük çaplı pipetler viral malzeme kullanımı ve vorteks yok <ol start="2"><li> Fenol-kloroform 5 ml ekleyerek viral proteinler ayıklayın ve bir emülsiyon korumak için hemen tersini veya vorteks başlar. 10 saniye boyunca karıştırın, sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 2000 RCF emülsiyon santrifüj. , Geniş çaplı bir pipet ucu ile üst tabaka toplama arayüzü kaçınarak, ve yeni bir tüpe transfer İsteğe bağlı: Bu adımda kullanın faz kilidi jel (PLG) tüpler arayüzü kirlenmesini önlemek amacıyla. </li><li> Fenol-kloroform ekstraksiyon tekrarlayın ve tekrar santrifüj. </li><li> Ikinci fenol-kloroform ekstraksiyon sonra, 30 ml cam Corex tüpe üst tabaka toplamak ve tüp -20 ° C'de 10-15 dakika soğuk dondurma olmadığını özen. </li><li> 10 ml buz gibi soğuk etanol, tüp örtüsü, (örneğin Parafilm M üstünden bir parça uzanan) ve hemen karıştırmak için ters. Ince bir vıcık vıcık çökelti oluşur görünür bir DNA "hayalet", dikkat edin. Hafifçe daha da karıştırmak ve yapışkan DNA birlikte küme çökeltileri neden Tüpü ters çevirin. </li><li> DNA hayalet (ler) yakalamak için bir bardak kanca kullanın. Dikkatlice aşırı sıvı kaldırmak için DNA blot, daha sonra 1.5 ml tüpe kanca (aşağı ucu) yerleştirin ve kurumasını bekleyin. Ekle 0.25 - 0.5 ml TE DNA hayalet çözülür. En az bir saat devam etmek için DNA tabanda İzin. 4 Mağaza DNA ° C İsteğe Bağlı: 1.5 ml tüp içine cam kanca kesiyorum, DNA verimi en üst düzeye çıkarmak için, cam parçaları kapalı böylece tabanda zamanla devam edebilirsiniz. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Hücreleri ile İçişleri Bakanlığı yeterince yüksek bir, yabani tip PRV suşları için ~ 18 saat sonrası enfeksiyon (HPI) içinde tam CPE ulaşmak, ve yabani tip HSV-1 suşu (Şekil 1) ~ 24 HPI. Bir kez enfekte hücrenin pelet hasat edilir, kalan protokol adımları tam bir uzun gün ya da iki gün (Şekil 2) üzerinden yürütülmektedir. DNA hayalet yakalamak için cam kanca hazırlarken, daha sonra 1.5 ml tüp tabanı (Şekil 3) içine sığabilecek kadar kanca açı 90 dereceden daha az olması, yapmak için önemlidir. Bu kanca ucu Sızdırmazlık pipetlemeyin içindeki DNA kaybını önler. DNA hayaletler yağış adım sırasında formu ve beyaz, vıcık vıcık ipler (Şekil 4) olarak görünecektir. Birbirleriyle ve / veya DNA yakalamak için kullanılan cam kanca Bu agrega ve sopa. Böylece aynı cam kanca yağış çözüm içinde birden çok iş parçacığı DNA toplamak için kullanılabilir. <table border="1"><tbody><tr><td> İstenen hacme dayalı sütunu seçin: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1.3 ml </td><td> 1.9 ml </td><td> 2.5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH, 7.4 ') </td><td> 300 ul </td><td> 450 ul </td><td> 600 ul </td><td> 1.2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 ul </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 ul </td><td> 15 ul </td><td> 20 ul </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 ul </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol (kullanmadan önce hemen eklemek) </td><td> 4.3 ul </td><td> 6.5 ul </td><td> 8.6 ul </td><td> 17.2 ul </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> İstenen yüzde gliserol (0, 5 veya 45%) oranlar kullanın </td></tr><tr><td> 0% gliserol </td><td> Hiçbiri </td><td> Hiçbiri </td><td> Hiçbiri </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td> su </td><td> 8.3 ml </td><td> 12.5 ml </td><td> 16.7 ml </td><td> 33.4 ml </td></tr><tr><td> % 5 gliserol </td><td> 0.5 ml </td><td> 0.8 ml </td><td> 1.0 ml </td><td> 2.0 ml </td></tr><tr><td> su </td><td> 7.8 ml </td><td> 11.7 ml </td><td> 15.7 ml </td><td> 31.4 ml </td></tr><tr><td> % 45 glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6.8 ml </td><td> 9.0 ml </td><td> 18.0 ml </td></tr><tr><td> su </td><td> 3.8 ml </td><td> 5.7 ml </td><td> 7.7 ml </td><td> 15.4 ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1. LCM tamponlar hazırlanması için tarifler <table border="1"><tbody><tr><td> 50 ml hacim için </td></tr><tr><td> 5 ml 1M NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 ml 1M Tris, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 1 ml 0,5 EDTA </td></tr><tr><td> 41.5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tablo 2. TNE (50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM EDTA 0,1 M NaCl) hazırlanması <table border="1"><tbody><tr><td> 1 L hacim için </td></tr><tr><td> 0.2 g KCl </td></tr><tr><td> 0.2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1L için H 2 O </td></tr></tbody></table> Tablo 3. PBS (1.5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 8.1 mM 2 HPO 4 Na; pH 7.0 2.7 mM KCl) hazırlanması <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: PK15 hücreleri enfeksiyon (A) önce, sonra (B) yüksek bir enfeksiyon çokluğu yarıda enfeksiyon yoluyla ve (C) sitopatik etki (CPE). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 protokol bakış. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Üç cam temsilcisi örnekler viral DNA hayaletler toplamak için kullanılan kanca. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 iyi biçimlenmiş ve bol miktarda DNA "hayalet" temsili bir örnek .

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol bölümleri başlangıçta BSL4 şartlarda viral DNA izolasyonu için geliştirilmiş, ancak bu eşit olmayan BSL koşulları iyi uyum 4. yaygın DNA genomların olan alfa-herpesvirüslerinin PRV ve HSV-1, DNA izole etmek için bu protokolü kullanan kapsid bir protein ve lipid bir zarf ile çevrili içine 7,8 Bununla beraber, beta ve gama-herpesvirüslerinin ve adenovirüs, büyük olasılıkla diğer büyük DNA virüsleri doğrudan uyarlanabilir. Benzer ekstraksiyon yaygın RNA virüsleri için de kullanılır. 9...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2 trikloro-1 ,2,2-trifluoroethane) </td><td> Balıkçı </td><td> T178-4 </td><td> Uygun bertaraf kurallar Freon içeren atıklar için kurum ile kontrol edin, ya da görmek Mendez et al. potansiyel Freon alternatifleri. 9 </td></tr><tr><td> Faz kilit jel tüpler, Ağır 15ml kapasiteli </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Isteğe bağlı </td></tr><tr><td> Polyallomer ultrasantrifüjdeki borular </td><td> Beckman * </td><td> 331.372 * </td><td> Kendi ultrasantrifüjdeki için uygun Select * tüpleri; bu sadece bir örnek olarak yer almaktadır </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 hücre </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero hücrelerinde </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

nucleocapsids gelen viral dna hazırlanması

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Virüsler zorunlu hücresel parazitler, ve böylece kendi DNA çalışma, konak hücre kirleticiler ve DNA viral malzeme izole gerektirir. Birkaç downstream uygulamalar bu protokolü tarafından sağlanan saf viral DNA, büyük miktarlarda gerektirir. Bu uygulamalar, viral genom konak DNA kaldırılması viral dizileri için veri çıkışı optimize etmek için çok önemlidir sıralama, ve yeni rekombinant virüs suşları üretimi, plazmid ve lineer viral DNA rekombinasyon kolaylaştırır saflaştırılmış co-transfeksiyon 1,2, 3 Bu prosedür, ekstraksiyon ve enfekte hücrelerden doğrusal herpesvirus nucleocapsid saflaştırılmış DNA izole etmek için yoğunluk tabanlı santrifüj bir kombinasyonunu kullanır. 4,5 ilk arıtma adımları ekstraksiyon ve santrifüj adımları sırasında viral DNA içermediğinden ve korumak, saflaştırılmış virüs capsids izole etmek amacı hücresel protein ve DNA kaldırmak. Nucleocapsids, Lizis sonra viral DNA açıklamaları ve son iki fenol-kloroform adımları kalan proteinler kaldırmak. Çözüm yakalanan son DNA, 1.90 ortalama OD 260/280 ile, son derece konsantre ve saf. Kullanılan enfekte hücreler, viral DNA aralığı 150-800 mg veya daha fazla verim miktarına bağlı olarak değişir. Bu DNA saflık 4C uzun süreli depolama sırasında istikrarlı hale getiriyor. Bu DNA böylece ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonları ve transfections için çok uygundur. Protokol başlamadan önce, çanak başına hücre (örneğin konfluent 15 cm çanak ortalama 8 x 10 6 PK-15 hücreleri) ve viral stokunun titresi (ortalama sayısını bilmek önemlidir. örneğin 1 x 10 ml başına 8 plak oluşturan birim). Bu protokol için uygun enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamak için gereklidir. Örneğin 6, 5 bir İçişleri Bakanlığı Yukarıdaki viral stoğu ile PK-15 hücreleri, biri 15 cm çanak bulaştırmak için, 400 ul 3.6 ml (15 cm plaka için toplam aşılama hacmi 4 ml) orta ile viral stok ve sulandırmak. Çoklu viral DNA preparatları aynı zamanda hazırlanabilir. Sadece ultrasantrifüjdeki rotor tarafından düzenlenen tüplerin sayısına göre eş zamanlı olarak hazırlıkları sayısı sınırlıdır (virüs başına bir adım aşağıda 3.9). Burada bir virüs için yapılıyor gibi prosedürü açıklar.

Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Virüsler zorunlu hücresel parazitlerdir ve bu nedenle DNA'larının incelenmesi, viral materyalin konak hücre kontaminasyonlarından ve DNA'sından izole edilmesini gerektirir. ...

Bu video, enfekte hücrelerden yüksek saflıkta viral nükleokapsid DNA'sı izole etme prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, çift serbest ekstraksiyon kullanılarak lipid membranlar denatüre edilir. Ardından, viral nükleokapsidleri çöktürmek ve onları daha hafif hücresel ve viral bileşenlerden ayırmak için numune ultrasantrifüj edilir.Pelletlenmiş nükleokapsidlerden viral DNA'yı serbest bırakmak için deterjanlar ve proteinaz K eklenir. Ardından, geri kalan tüm proteinleri uzaklaştırmak için çift fenil kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirilir. Son olarak, viral DNA çözelti içerisinde çöktürülür.Sonuç olarak, bu enfekte hücrelerden yüksek konsantrasyona sahip ve saf viral DNA izole edildiği görülmektedir. Bu tekniğin, serbest ekstraksiyonlar veya ultrasantrifüj içermeyen mevcut yöntemlere göre temel avantajı, burada üretilen viral DNA'nın çok düşük düzeyde konakçı DNA kontaminasyonu içermesidir; bu da onu PCR ve viral genomların derin sekanslaması gibi sonraki prosedürler için ideal hale getirir. Bu yöntemi ilk kez, ek önlem tedbirlerinin yüksek önem taşıdığı rekombinant DNA çalışmalarının ilk günlerinde kullandık.BSL 4 koşulları altında, bir glove box içerisinde çalışırken viral DNA iz

preparation-of-viral-dna-from-nucleocapsids

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir...

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Bu videoda, yetişkin erkek Drosophila sineklerine pozitif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsünün nano enjeksiyonunu gerçekleştirmek ve ardından enfeksiyon nedeniyle başlatılan antiviral yanıtları incelemek için bir prosedürü açıklıyoruz. Polimeraz zincir reaksiyonu analizi, enfekte sineklerde RNA interferansı ve JAK/STAT sinyali dahil olmak üzere bağışıklık yanıt yollarının aktivasyonunu gösteren spesifik genlerin yukarı regülasyonunu tanımlar.

Yetişkin Sineklerde Konak-Virüs Etkileşimlerini İncelemek için İntratorasik Viral Nano Enjeksiyon

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Virüsün konak hücrelere girişi sırasında influenza A virüs çekirdeklerinin sökülmesi çok adımlı bir işlemdir. Viral kaplamanın erken aşamalarını analiz etmek için bir in vitro yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımda, tanımlanmış koşullar altında kaplamayı başlatan adımları biyokimyasal olarak incelemek için hız gradyan santrifüjlemesi kullanılır.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Bu protokol, insan klinik izolatlarından alınan viral örneklerin tarafsız RNA dizilimi için hızlı ve geniş çapta uygulanabilir bir yöntemi tanımlar.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

Öğrenin, enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirüs nükleokapsit DNA'sı izolasyonu için ultrasantrifüjasyon ve fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak viroloji araştırmalarında yüksek verimli dizileme ve transfeksiyon uygulamaları için ideal saflıkta viral DNA elde etme yöntemini.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Daha fazla video keşfet