Name: Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Öğrenin, enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirüs nükleokapsit DNA'sı izolasyonu için ultrasantrifüjasyon ve fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak viroloji araştırmalarında yüksek verimli dizileme ve transfeksiyon uygulamaları için ideal saflıkta viral DNA elde etme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarları Greg Smith, Lisa Pomeranz, Matt Lyman Marlies Eldridge, Halina Staniszewska Goraczniak, Enquist laboratuvar ince ayar bu protokol üyeleri ve katkıları için teşekkür ederiz.

1. İlk Gün: Viral Enfeksiyon ve Tamponlar hazırlanması <ol><li> Doku kültürü enfeksiyon hücreleri 5-10 yemekleri hazırlayın (15 cm çapında), örneğin pseudorabies virüs (PRV) veya herpes Vero hücreleri PK-15 hücreleri virüs simpleks (HSV). </li><li> Hücreleri 95 -% 100 birleşmiş, bir (İçişleri Bakanlığı) 5-10 onları bozar. Bunu yapmak için, plaka, plaka başına 4 ml toplam hacmi virüs stok kullanılarak her aşılamak, daha sonra 37 tabak az 1 saat inkübe ° C Rock plates yavaşça her 15 dakikada bir hücre tek tabaka virüs inokulum tarafından tamamen kaplı kalmasını sağlamak için. Bu arada, bir sonraki adım için ortam sıcak. </li><li> Bir saat sonra enfeksiyon, viral inokulum plakalardan aspire 15 ml sıcak orta ekleyin ve 37 ° C'de 12-20 saat süreyle nemlendirilmiş bir inkübatör. </li><li> LCM tamponlar (bkz. Tablo 1) ve geceleme kaya 4 ° C tam karıştırma için hazırlayın. (Bkz. Tablo 2) viral DNA tabanda için TNE hazırlayın. </li></ol> 2. İkinci Gün, 1. Aşama: Hücre Lizis ve Ultrasantrifügasyon <ol><li> Görme hücre enfeksiyon tekdüze sitopatik etki (CPE) neden oldu onaylamak. Tüm hücreleri yuvarlak var, ama plaka kaldırdı kadar enfeksiyon ilerlemeye izin ver. </li><li> Enfekte olmuş hücreleri ortama Pençe ve 50 ml konik tüpler içine hücreleri ve orta birleştirmek. Bu adım için gerekli konik tüpler sayısı yukarıdaki Adım 1.2 enfeksiyon için kullanılan yemekler sayısına bağlı olacaktır, örneğin bir 50 ml konik tüp maksimum 3 yemekler her Opsiyonel 15 ml orta pelet kullanılır: durulayın 10 ml PBS ile plakaları ve hücreleri ve orta ile birleştirir. </li><li> Santrifüj hücreleri ve 2000 oda sıcaklığında göreceli centifugal kuvveti (RCF) 10 dakika orta, sonra supernatant aspirat ve 10 ml PBS her pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Bir viral enfeksiyon pelet Adım 2.2 'de birden fazla konik tüpler içine yayılmış ise, bu adım konik bir tüp içine recombined olabilir. Tekrar santrifüj ve aspirasyon Opsiyonel: Bu pelet -20 ° C'de saklanır ve protokol, daha sonraki bir zamanda devam edilebilir . </li></ol> 3. İkinci Gün, 2. Aşama: Ultrasantrifügasyon Aşağıdaki adımları sırasında hücre pelet ve buz üzerinde LCM tamponlar zaman tutun. <ol><li> 0% gliserol β-mercaptoethanol Ekle - LCM tampon. Ayarlayarak ultrasantrifüjdeki (aşağıda adım 3.9) soğutma başlayın 4 ° C ve vakum açma. </li><li> Uzun clumpy kadar LCM tampon - 0% gliserol 5 ml hücre pelletini tekrar. Gerekirse tüp herhangi bir çözünmemiş hücre pelletini break up, girdap. </li><li> 1.5 ml Freon (1,1,2-trikloro-1 ,2,2-trifluoroethane) ekleyerek ve şiddetle vorteks ayıklayın. Hemen 4 ° C sıcaklıkta 2000 RCF az 10 dakika süreyle santrifüj Geniş çaplı bir pipet (arayüz kaçınarak) ile üst katman toplayın ve yeni bir tüp Opsiyonel transferi: pelet jelatinimsi bir katı ise, yeni bir tüp içine hızlı bir şekilde en üst tabakasını dökmek. </li><li> Freon çıkarma tekrarlayın ve tekrar santrifüj. </li><li> En üst tabakası (~ 5 ml) toplayın ve yeni bir polyallomer ultrasantrifüjdeki tüp transfer. LCM tamponlar kalan iki gliserol β-mercaptoethanol ekleyin. </li><li> LCM (orta tabaka), ve sonra tekrar 2.5 ml% 45 gliserol ile underlaying - - LCM (alt tabaka) 3 ml% 5 gliserol ile Freon ekstraktı (üst tabaka) underlaying polyallomer santrifüj tüpüne bir degrade hazırlayın. Tüp içeriğinin taşma önlemek için ince bir pipet kullanın. </li><li> Gerekirse, LCM tamponlar aynı oranlarda kullanarak eşdeğer bir denge tüp hazırlayın. </li><li> Tüpler ultrasantrifüjdeki kova içine aktarın. LCM tampon üst tabakası (bir kerede ~ 50-100 ul) - hafifçe ekstra% 0 gliserol ekleyerek, 0,1 g birbirlerinin içinde kova Dengesi. </li><li> Yatay veya sallanan bir kova rotor soğuk bir ultrasantrifüjdeki kullanarak, 77,000 RCF (örneğin bir SW41Ti rotor için 25.000 rpm), 4 ° C sıcaklıkta 1 saat süreyle dengeli örnekleri Spin </li><li> Ultrasantrifügasyon sırasında, etanol yağış adım (4.6), kayan DNA yakalamak için bir cam kanca olun. Bir bardak yeniden süspanse her iki ucundan tutun ve bir alev üzerinde orta bölümü askıya. Cam bir bölüm neredeyse erimiş olduğunda, cam germek için nazikçe çekin sıkıca açılı bir kanca (&lt;90 derece) oluşturmak için hafifçe bükün, ve sonunda mühür keskin çekin. Cam, cam kanca ucu açık ise kapatmak için yeterli erir, böylece ateşte ucu tutun. </li><li> Ultrasantrifügasyon sonra, ince bir opak pelet ortasında karanlık bir nokta göreceksiniz. Dikkatle tüpten kenarları boyunca damlayan da dahil olmak üzere sıvı aspire, ancak tüpün alt kısmında pelet kaçınarak. </li><li> Oda sıcaklığında 0,5 ml TNE ekleyin. </li><li> Pelet, pelet hidrasyon sağlamak için en az 10 dakika oturup Optional: 4 tutulması durumunda pelet gecede TNE tekrar süspansiyon ° C </li></ol> 4. Üçüncü Gün: "Ghost" DNA Yağış <ol><li> Küçük çaplı bir pipet ucu (örneğin bir P200 pipet) ile pipetleme pelet kadar Break . Viral DNA, hala bu noktada capsids bulunan olduğundan, bu aşamada kesme hakkında endişelenmeyin. Capsids yok oda sıcaklığında viral pelet, içeren tüp aşağıdaki reaktifler ekleyin: <ul><li> 4.25 ml TNE </li><li> 0.25 ml% 10 SDS </li><li> 2 mg Proteinaz K </li></ul> Bu reaktifler karıştırmak için yavaşça sallayın. Viskozite hafif bir artış olmalıdır. </li></ol> Burada kesme dikkat edin, örneğin büyük çaplı pipetler viral malzeme kullanımı ve vorteks yok <ol start="2"><li> Fenol-kloroform 5 ml ekleyerek viral proteinler ayıklayın ve bir emülsiyon korumak için hemen tersini veya vorteks başlar. 10 saniye boyunca karıştırın, sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 2000 RCF emülsiyon santrifüj. , Geniş çaplı bir pipet ucu ile üst tabaka toplama arayüzü kaçınarak, ve yeni bir tüpe transfer İsteğe bağlı: Bu adımda kullanın faz kilidi jel (PLG) tüpler arayüzü kirlenmesini önlemek amacıyla. </li><li> Fenol-kloroform ekstraksiyon tekrarlayın ve tekrar santrifüj. </li><li> Ikinci fenol-kloroform ekstraksiyon sonra, 30 ml cam Corex tüpe üst tabaka toplamak ve tüp -20 ° C'de 10-15 dakika soğuk dondurma olmadığını özen. </li><li> 10 ml buz gibi soğuk etanol, tüp örtüsü, (örneğin Parafilm M üstünden bir parça uzanan) ve hemen karıştırmak için ters. Ince bir vıcık vıcık çökelti oluşur görünür bir DNA "hayalet", dikkat edin. Hafifçe daha da karıştırmak ve yapışkan DNA birlikte küme çökeltileri neden Tüpü ters çevirin. </li><li> DNA hayalet (ler) yakalamak için bir bardak kanca kullanın. Dikkatlice aşırı sıvı kaldırmak için DNA blot, daha sonra 1.5 ml tüpe kanca (aşağı ucu) yerleştirin ve kurumasını bekleyin. Ekle 0.25 - 0.5 ml TE DNA hayalet çözülür. En az bir saat devam etmek için DNA tabanda İzin. 4 Mağaza DNA ° C İsteğe Bağlı: 1.5 ml tüp içine cam kanca kesiyorum, DNA verimi en üst düzeye çıkarmak için, cam parçaları kapalı böylece tabanda zamanla devam edebilirsiniz. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Hücreleri ile İçişleri Bakanlığı yeterince yüksek bir, yabani tip PRV suşları için ~ 18 saat sonrası enfeksiyon (HPI) içinde tam CPE ulaşmak, ve yabani tip HSV-1 suşu (Şekil 1) ~ 24 HPI. Bir kez enfekte hücrenin pelet hasat edilir, kalan protokol adımları tam bir uzun gün ya da iki gün (Şekil 2) üzerinden yürütülmektedir. DNA hayalet yakalamak için cam kanca hazırlarken, daha sonra 1.5 ml tüp tabanı (Şekil 3) içine sığabilecek kadar kanca açı 90 dereceden daha az olması, yapmak için önemlidir. Bu kanca ucu Sızdırmazlık pipetlemeyin içindeki DNA kaybını önler. DNA hayaletler yağış adım sırasında formu ve beyaz, vıcık vıcık ipler (Şekil 4) olarak görünecektir. Birbirleriyle ve / veya DNA yakalamak için kullanılan cam kanca Bu agrega ve sopa. Böylece aynı cam kanca yağış çözüm içinde birden çok iş parçacığı DNA toplamak için kullanılabilir. <table border="1"><tbody><tr><td> İstenen hacme dayalı sütunu seçin: </td><td> 10 ml </td><td> 15 ml </td><td> 20 ml </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td> 1M KCL </td><td> 1.3 ml </td><td> 1.9 ml </td><td> 2.5 ml </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris (pH, 7.4 ') </td><td> 300 ul </td><td> 450 ul </td><td> 600 ul </td><td> 1.2 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 ul </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> 0,5 EDTA </td><td> 10 ul </td><td> 15 ul </td><td> 20 ul </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 ul </td><td> 75 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol (kullanmadan önce hemen eklemek) </td><td> 4.3 ul </td><td> 6.5 ul </td><td> 8.6 ul </td><td> 17.2 ul </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> İstenen yüzde gliserol (0, 5 veya 45%) oranlar kullanın </td></tr><tr><td> 0% gliserol </td><td> Hiçbiri </td><td> Hiçbiri </td><td> Hiçbiri </td><td> Hiçbiri </td></tr><tr><td> su </td><td> 8.3 ml </td><td> 12.5 ml </td><td> 16.7 ml </td><td> 33.4 ml </td></tr><tr><td> % 5 gliserol </td><td> 0.5 ml </td><td> 0.8 ml </td><td> 1.0 ml </td><td> 2.0 ml </td></tr><tr><td> su </td><td> 7.8 ml </td><td> 11.7 ml </td><td> 15.7 ml </td><td> 31.4 ml </td></tr><tr><td> % 45 glycerol </td><td> 4,5 ml </td><td> 6.8 ml </td><td> 9.0 ml </td><td> 18.0 ml </td></tr><tr><td> su </td><td> 3.8 ml </td><td> 5.7 ml </td><td> 7.7 ml </td><td> 15.4 ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1. LCM tamponlar hazırlanması için tarifler <table border="1"><tbody><tr><td> 50 ml hacim için </td></tr><tr><td> 5 ml 1M NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 ml 1M Tris, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 1 ml 0,5 EDTA </td></tr><tr><td> 41.5 ml H 2 O </td></tr></tbody></table> Tablo 2. TNE (50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM EDTA 0,1 M NaCl) hazırlanması <table border="1"><tbody><tr><td> 1 L hacim için </td></tr><tr><td> 0.2 g KCl </td></tr><tr><td> 0.2 g KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 g NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1L için H 2 O </td></tr></tbody></table> Tablo 3. PBS (1.5 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 8.1 mM 2 HPO 4 Na; pH 7.0 2.7 mM KCl) hazırlanması <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: PK15 hücreleri enfeksiyon (A) önce, sonra (B) yüksek bir enfeksiyon çokluğu yarıda enfeksiyon yoluyla ve (C) sitopatik etki (CPE). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 protokol bakış. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Üç cam temsilcisi örnekler viral DNA hayaletler toplamak için kullanılan kanca. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 iyi biçimlenmiş ve bol miktarda DNA "hayalet" temsili bir örnek .

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol bölümleri başlangıçta BSL4 şartlarda viral DNA izolasyonu için geliştirilmiş, ancak bu eşit olmayan BSL koşulları iyi uyum 4. yaygın DNA genomların olan alfa-herpesvirüslerinin PRV ve HSV-1, DNA izole etmek için bu protokolü kullanan kapsid bir protein ve lipid bir zarf ile çevrili içine 7,8 Bununla beraber, beta ve gama-herpesvirüslerinin ve adenovirüs, büyük olasılıkla diğer büyük DNA virüsleri doğrudan uyarlanabilir. Benzer ekstraksiyon yaygın RNA virüsleri için de kullanılır. 9...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Freon (1,1,2 trikloro-1 ,2,2-trifluoroethane) </td><td> Balıkçı </td><td> T178-4 </td><td> Uygun bertaraf kurallar Freon içeren atıklar için kurum ile kontrol edin, ya da görmek Mendez et al. potansiyel Freon alternatifleri. 9 </td></tr><tr><td> Faz kilit jel tüpler, Ağır 15ml kapasiteli </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> Isteğe bağlı </td></tr><tr><td> Polyallomer ultrasantrifüjdeki borular </td><td> Beckman * </td><td> 331.372 * </td><td> Kendi ultrasantrifüjdeki için uygun Select * tüpleri; bu sadece bir örnek olarak yer almaktadır </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> Sigma </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 hücre </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero hücrelerinde </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

nucleocapsids gelen viral dna hazırlanması

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Virüsler zorunlu hücresel parazitler, ve böylece kendi DNA çalışma, konak hücre kirleticiler ve DNA viral malzeme izole gerektirir. Birkaç downstream uygulamalar bu protokolü tarafından sağlanan saf viral DNA, büyük miktarlarda gerektirir. Bu uygulamalar, viral genom konak DNA kaldırılması viral dizileri için veri çıkışı optimize etmek için çok önemlidir sıralama, ve yeni rekombinant virüs suşları üretimi, plazmid ve lineer viral DNA rekombinasyon kolaylaştırır saflaştırılmış co-transfeksiyon 1,2, 3 Bu prosedür, ekstraksiyon ve enfekte hücrelerden doğrusal herpesvirus nucleocapsid saflaştırılmış DNA izole etmek için yoğunluk tabanlı santrifüj bir kombinasyonunu kullanır. 4,5 ilk arıtma adımları ekstraksiyon ve santrifüj adımları sırasında viral DNA içermediğinden ve korumak, saflaştırılmış virüs capsids izole etmek amacı hücresel protein ve DNA kaldırmak. Nucleocapsids, Lizis sonra viral DNA açıklamaları ve son iki fenol-kloroform adımları kalan proteinler kaldırmak. Çözüm yakalanan son DNA, 1.90 ortalama OD 260/280 ile, son derece konsantre ve saf. Kullanılan enfekte hücreler, viral DNA aralığı 150-800 mg veya daha fazla verim miktarına bağlı olarak değişir. Bu DNA saflık 4C uzun süreli depolama sırasında istikrarlı hale getiriyor. Bu DNA böylece ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonları ve transfections için çok uygundur. Protokol başlamadan önce, çanak başına hücre (örneğin konfluent 15 cm çanak ortalama 8 x 10 6 PK-15 hücreleri) ve viral stokunun titresi (ortalama sayısını bilmek önemlidir. örneğin 1 x 10 ml başına 8 plak oluşturan birim). Bu protokol için uygun enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamak için gereklidir. Örneğin 6, 5 bir İçişleri Bakanlığı Yukarıdaki viral stoğu ile PK-15 hücreleri, biri 15 cm çanak bulaştırmak için, 400 ul 3.6 ml (15 cm plaka için toplam aşılama hacmi 4 ml) orta ile viral stok ve sulandırmak. Çoklu viral DNA preparatları aynı zamanda hazırlanabilir. Sadece ultrasantrifüjdeki rotor tarafından düzenlenen tüplerin sayısına göre eş zamanlı olarak hazırlıkları sayısı sınırlıdır (virüs başına bir adım aşağıda 3.9). Burada bir virüs için yapılıyor gibi prosedürü açıklar.

Biz enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirus nucleocapsid DNA izole süreci tanımlamak. Çözüm yakalanan son DNA ideal, yüksek verimlilik sıralama, yüksek sadakat PCR reaksiyonlar, ve yeni virüs rekombinantlar üretmek için transfections için uygun, yüksek konsantrasyon ve saflık.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Virüsler zorunlu hücresel parazitlerdir ve bu nedenle DNA'larının incelenmesi, viral materyalin konak hücre kontaminasyonlarından ve DNA'sından izole edilmesini gerektirir. ...

Bu video, enfekte hücrelerden yüksek saflıkta viral nükleokapsid DNA'sı izole etme prosedürünü göstermektedir. İlk olarak, çift serbest ekstraksiyon kullanılarak lipid membranlar denatüre edilir. Ardından, viral nükleokapsidleri çöktürmek ve onları daha hafif hücresel ve viral bileşenlerden ayırmak için numune ultrasantrifüj edilir.Pelletlenmiş nükleokapsidlerden viral DNA'yı serbest bırakmak için deterjanlar ve proteinaz K eklenir. Ardından, geri kalan tüm proteinleri uzaklaştırmak için çift fenil kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirilir. Son olarak, viral DNA çözelti içerisinde çöktürülür.Sonuç olarak, bu enfekte hücrelerden yüksek konsantrasyona sahip ve saf viral DNA izole edildiği görülmektedir. Bu tekniğin, serbest ekstraksiyonlar veya ultrasantrifüj içermeyen mevcut yöntemlere göre temel avantajı, burada üretilen viral DNA'nın çok düşük düzeyde konakçı DNA kontaminasyonu içermesidir; bu da onu PCR ve viral genomların derin sekanslaması gibi sonraki prosedürler için ideal hale getirir. Bu yöntemi ilk kez, ek önlem tedbirlerinin yüksek önem taşıdığı rekombinant DNA çalışmalarının ilk günlerinde kullandık.BSL 4 koşulları altında, bir glove box içerisinde çalışırken viral DNA izole etmek için bu prosedürü geliştirdik. Gradyan oluşumu ve DNA ghosting basamaklarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bunun nedeni, gradyan katmanlamanın son derece sabit bir el gerektirmesi ve çözeltide çöken DNA ghost'un, daha önceden tespit etme deneyiminiz yoksa görülmesinin zor olabilmesidir.Bu prosedüre, enfeksiyon için beş ila 10 adet 15 santimetre çapında doku kültürü hücresi plağı hazırlayarak başlayın. Burada, PK 15 hücreleri psödo kuduz virüsü ile enfeksiyon için hazırlanır; hücreler %95 ila %100 konfluens düzeyine ulaştığında, besiyeri virüs içeren dört mililitre besiyeri ile değiştirilir. 5 ila 10 MOI değerinde, plakları nemlendirilmiş 37 °C inkübatörde %5 CO2 altında her 15 dakikada bir olmak üzere bir saat boyunca inkübe edin.Hücre monotabakasının virüs inokulumu ile tamamen kaplı kaldığından emin olmak için plakaları nazikçe sallayın. İnkübasyon sırasında, bir sonraki adım için medyumu ısıtın. Bir saatlik enfeksiyondan sonra, viral inokulumu plakalardan aspire edin.Ardından 15 mililitre ılık besiyeri ekleyin ve nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de 12 ila 20 saat boyunca inkübe edin. Son olarak, ertesi günkü deneylere hazırlık amacıyla taze LCM ve TNE tamponları hazırlayın. NP 40 eklenmesinin, acquis solüsyonunda şeritlerin oluşmasına yol açacağını unutmayın.Hazırlanan çözeltileri dört derece Celsius'ta gece boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Ertesi güne kadar çözeltiler tamamen bütünleşmiş olmalıdır. Ertesi gün, kabı bir bileşik mikroskobun tablasına yerleştirin ve hücre enfeksiyonunun tekdüze sitopatik etkiye neden olduğunu görsel olarak doğrulayın.Tüm hücreler yuvarlaklaşmış olmalı, ancak plaktan ayrılmamış olmalıdır. Hücreler henüz yuvarlaklaşmadıysa, sitopatik etkiler gözlemlenene kadar inkübasyona devam edin. Ardından, enfekte hücreleri kazıyarak besiyerine aktarın ve verimi artırmak için besiyerindeki hücreleri 50 mililitrelik konik tüplerde birleştirin.Plakaları 10 milliliters PBS ile durulayın ve besiyerindeki hücrelerle birleştirin, ardından kalan besiyeri ve serumu uzaklaştırmak için hücreleri ve besiyerini oda sıcaklığında 2000 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin; süpernatantı aspire edin ve peleti 10 milliliters PBS içinde yeniden süspande edin. Santrifüj ve aspirasyon işlemlerini tekrarlayın. Deneye aynı gün devam edilmeyecekse, peleti bu bölümde gösterilen adımlarda kullanılana kadar minus 20 degrees Celsius'ta saklayın.Hücre peletini ve LCM tamponlarını mümkün olduğunca buz üzerinde tutmak önemlidir. Beamer capto etanolün final konsantrasyonu 0,043% olacak şekilde %0 gliserol içeren LCM tamponuna Beamer capto etanol ekleyerek ultra santrifüj için hazırlık yapın. Ayrıca, ultrasentrifüjü 4 °C'ye ayarlayarak ve cihaz soğurken vakumu açarak hazırlayın. Hücre peletine 0,043% Beamer capto etanol içeren 5 mL %0 gliserol LCM tamponu ekleyin ve peleti yeniden süspande etmek için pipetle yukarı aşağı çekin.Gerekirse tüm topakların dağıldığından emin olun. Çözünmemiş hücre peletini dağıtmak için tüpü vorteksleyin. Ardından, hücresel ve viral membranları ekstrakte etmek için 1.5 milliliters ekleyin.Freon örneğini hemen kuvvetlice vorteksleyin. 4 °C'de 2000 RCF ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından iki tabaka oluşacaktır.Üstteki sulu faz tabakası viral nükleokapsid ve proteinleri içerirken, alttaki Freon tabakası viral ve hücresel membranları içerir. Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, ara yüzeye değdirmeden üst tabakayı toplayın ve yeni bir 50 milliliter konik tüpe aktarın. Freon tabakasına dokunmaktan ve bu organik çözücüyü yeni tüpteki sulu faz tabakasına taşımaktan kaçınmak önemlidir.Santrifüjleme işlemini takiben Freon ekstraksiyonunu tekrarlamak için daha önce yapıldığı gibi freon ekleyin ve vorteksleyin. Üst tabakadan yaklaşık beş mililitre toplayın ve yeni bir polimer ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Kalan iki gliserol LCM tamponuna 0,043% oranında beamr capto etanol ekleyin.Ardından, polimer santrifüj tüpünde bir gradyan hazırlamak için, Freon ekstraktının altına ince bir pipet yardımıyla 3 mL %5 gliserollü LCM ekleyin. Daha sonra bunun altına 2,5 mL %45 gliserollü LCM ekleyin. Ayrıca, gerekirse, aynı oranlarda LCM tamponları kullanarak eşdeğer bir dengeleme tüpü hazırlayın.Tüpleri ultrasantrifüj kovalarına yerleştirin ve üst katmana her seferinde 50 ila 100 µL %0 gliserol LCM tamponu dikkatlice ekleyerek tüpleri birbirine göre 0,1 gram toleransla dengeleyin. Dengelenmiş numuneleri ultrasantrifügasyon sırasında dört °C'de, 77,000 RCF hızında bir saat boyunca döndürün. Etanol çöktürme aşamasında yüzen DNA'yı yakalamak için bir kanca oluşturmak üzere cam past pipet kullanın.Pipetin her iki ucundan tutun ve orta kısmını alevin üzerinde tutun. Camın bir bölümü ısındığında, camı germek için hafifçe çekin. 90 derecenin altında dar açılı bir kanca oluşturmak için yavaşça bükün ve ucu kapatmak için hızla çekin.Cam kancanın ucu açıksa, cam kapanacak kadar eriyene dek ucu alev üzerinde tutun. Ultrasantrifüj işleminden sonra, ortasında viral nükleokapsidleri içeren koyu renkli bir nokta bulunan ince, opak bir pelet oluşacaktır. Tüpün yan duvarlarındaki damlacıklar da dahil olmak üzere sıvıyı, tüpün dibindeki pelete dokunmadan dikkatlice aspire edin.Oda sıcaklığında 0.5 milliliters TNE ekleyin. Pelletin hidrasyonu için pelletin en az 10 dakika beklemesine izin verin. İşleme ertesi güne kadar devam edilmeyecekse, resüspande edilen pelleti dört degrees Celsius'ta saklayın.P 200 uç kullanarak, pipetle yukarı-aşağı çekme işlemiyle hidrate pellet'i parçalayın. Bu aşamada viral DNA hâlâ kapsidlerin içinde olduğu için kesilme (shearing) konusunda endişelenmeyin. Kapsidleri açmak için viral pellet'e oda sıcaklığında 4,25 milliliters TNE, 0.25 milliliters %10 SDS ve iki milligrams protein EK ekleyin.Nazikçe sallayınız. Bu reaktifleri karıştırmak için. Kapsidlerin parçalanmış olması nedeniyle viskozitede hafif bir artış olmalıdır; DNA'nın kesilmemesine dikkat edilmelidir, geniş ağızlı pipetler kullanılmalı ve viral proteinleri ekstrakte etmek için viral materyal vortekslenmemelidir.Numuneyi bir faz kilitleme jel tüpüne aktarın ve beş mililitre fenol kloroform ekleyin. Emülsiyon karışımını korumak için hemen, en az 10 saniye boyunca tersyüz ederek karıştırmaya başlayın. Ardından emülsiyonu oda sıcaklığında 2000 RCF'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işleminin ardından, üst katmanı alarak yeni bir faz kilitleme jel tüpüne aktarın. Fenol kloroform ekstraksiyonunu tekrarlayın ve ikinci fenol kloroform ekstraksiyonundan sonra tekrar santrifüjleyin. Üst katmanı 30 milliliter'lik bir cam coex tüpüne toplayın ve tüpü -20 °C'de 10 ila 15 dakika boyunca soğutun.Donmadığından emin olun. 10 mililitre soğuk etanol ekleyin. Tüpü kapatın ve karıştırmak için ters çevirin.Hemen ardından, ince ve ipliksi bir çökelekten oluşan DNA hayaletinin belirmesini gözlemleyin. Yapışkan DNA çökeleklerinin birbirine kümelenmesini sağlamak ve daha fazla karıştırmak için tüpü nazikçe ters çevirin. Son olarak, DNA hayaletlerini çıkarmak için bir cam kanca kullanın ve fazla sıvıyı uzaklaştırmak için DNA'ya bir kim wipe ile hafifçe dokunarak dikkatlice kurulayın.Ardından kanca ucunu 1,5 milliliter tüpün içine yerleştirin. DNA verimini maksimize etmek için cam kancayı 1,5 milliliter tüpün içinde kırın; böylece cam parçacıklarının süspansiyonu zamanla devam edebilir. Kurumasını bekleyin ve DNA hayaletini çözmek için 0,25 ila 0,5 milliliters te ekleyin.DNA'nın yeniden süspansiyon işleminin en az bir saat sürmesine izin verin ve DNA'yı dört derece Celsius'ta saklayın. Viral DNA, bu video makalesinde açıklandığı üzere nükleokapsidlerden hazırlanmıştır; burada, çözeltide çöktürülmüş lineer viral genomik DNA'dan oluşan, iyi oluşmuş ve bol miktarda bulunan bir DNA ghost'un temsili bir örneği gösterilmektedir. Zincirler birbirine kümelenir ve bir Acquia çözeltisine yerleştirildiklerinde yeniden hidrate olmaları için zamana ihtiyaç duyarlar. PRV suşları Becker Bartha ve ek dört suştan hazırlanan viral DNA, %0,5 agros jel üzerinde bir saat boyunca yürütülmüş ve ethenia bromür ile boyanmıştır.Her PRV örneği, solda toplam 250 mikrolitre hacimdeki viral DNA nükleokapsid preparasyonundan bir mikrolitre kullanır. Lambda bakteri fajı DNA merdiveni, sindirilmemiş lambda DNA'sının büyük boyutunu (48,5 KILOBASE çift) ve PRV genomik DNA'sını (yaklaşık 140 kilobase çift) göstermektedir.Ardından, bilinen miktarlardaki Lambda DNA'dan oluşturulan bir dilüsyon serisi, sağdaki PRV örneklerinin konsantrasyonunun µL başına 50 ila 200 nanogram arasında değiştiğini ve viral başına toplam verimin 12 ila 50 mikrogram olduğunu göstermektedir. Dört PRV suşundan hazırlanan viral DNA örnekleri, BAM H I veya KPN I ile gece boyunca digeste edilmiştir. Restriksiyon enzimleri ile digeste edilen DNA örnekleri, %0,8 agroz jel üzerinde gece boyunca elektroforez ile ayrılmış ve etidyum bromür ile boyanmıştır.H 1 şeritleri sekiz mikrogram viral nükleokapsid DNA içerirken, KPN 1 şeritleri dört mikrogram viral DNA içerir. Farklı PRV suşları, kendilerine özgü restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi paternleri ile ayırt edilebilir. Bu prosedürün ardından, viral genom içeriğine ilişkin veriler elde etmek amacıyla derin sekanslama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik; viroloji alanındaki araştırmacıların viral DNA'yı restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmleri (RFLP'ler), Southern blotting, rekombinant klonlama, DNA virüs konstrüksiyonu ve herpes virüsleri ile diğer virüs türlerinin diğer manipülasyonları yoluyla karakterize etmelerinin önünü açmıştır.fon ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür uygulanırken çeker ocak altında çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Peletlemeden sonra, fon tabakası jelsi yarı katı formdan sıvı forma hızla dönüşebilir; bu nedenle, sulu üst tabakayı toplamak için dökmenin mi yoksa pipetlemenin mi en iyi yöntem olduğuna karar vermeden önce her tüp ayrı ayrı değerlendirilmelidir.

preparation-of-viral-dna-from-nucleocapsids

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Ile bitki hücreleri için birden fazla viral bileşenlerinin teslim senkronize etmek için basit, verimli ve sağlam bir...

Basit ve Sağlam In vivo Ve In vitro</emVirüs Meclisi Öğrenmenin> Yaklaşım

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Bu videoda, yetişkin erkek Drosophila sineklerine pozitif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsünün nano enjeksiyonunu gerçekleştirmek ve ardından enfeksiyon nedeniyle başlatılan antiviral yanıtları incelemek için bir prosedürü açıklıyoruz. Polimeraz zincir reaksiyonu analizi, enfekte sineklerde RNA interferansı ve JAK/STAT sinyali dahil olmak üzere bağışıklık yanıt yollarının aktivasyonunu gösteren spesifik genlerin yukarı regülasyonunu tanımlar.

Yetişkin Sineklerde Konak-Virüs Etkileşimlerini İncelemek için İntratorasik Viral Nano Enjeksiyon

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Virüsün konak hücrelere girişi sırasında influenza A virüs çekirdeklerinin sökülmesi çok adımlı bir işlemdir. Viral kaplamanın erken aşamalarını analiz etmek için bir in vitro yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımda, tanımlanmış koşullar altında kaplamayı başlatan adımları biyokimyasal olarak incelemek için hız gradyan santrifüjlemesi kullanılır.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.

İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Bu protokol, insan klinik izolatlarından alınan viral örneklerin tarafsız RNA dizilimi için hızlı ve geniş çapta uygulanabilir bir yöntemi tanımlar.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Bu iletişim kuralı, özellikle etiket ve seçmeli olarak viral genom ilişkili proteinler karakterizasyonu için virüslü hücrelerinden viral DNA izole etmek için hedeftir.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.

Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı

Öğrenin, enfekte hücrelerden yüksek saflıkta herpesvirüs nükleokapsit DNA'sı izolasyonu için ultrasantrifüjasyon ve fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak viroloji araştırmalarında yüksek verimli dizileme ve transfeksiyon uygulamaları için ideal saflıkta viral DNA elde etme yöntemini.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Daha fazla video keşfet