Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Koku alma duyumuz, dış ortamdaki uçucu kimyasalları tespit etmemize ve tanımamıza olanak tanır. Kokular, olfaktör duyusal nöronların uçlarındaki reseptörlere bağlanır ve siklik nükleotid kapılı kanalların açılmasını, ardından kalsiyum aktivasyonlu klorür kanallarının açılmasını sağlayan bir transdüksiyon kaskadını aktive eder. Bu prosedürün genel amacı, kafesle korunmuş bileşikler (cage compounds) kullanılarak bu kanalların doğrudan nasıl aktive edileceğini göstermektir; kafesle korunmuş bileşikler, kimyasal bir kafes aracılığıyla fizyolojik olarak inaktif hale getirilmiş moleküllerdir.

Ultraviyole ışık flaşı bir kafesi kırar ve fizyolojik olarak aktif bileşik kafeslerini serbest bırakır. Hücre içi solüsyonuna eklenen Cycl, mp veya kafes kalsiyum, patch pipetiyle doldurulur ve koku alma duyusal nöronlarının sitoplazmasına difüze olur. Tüm hücre voltaj klempleme konfigürasyonunda akımı ölçmek için patch clamp kayıtları alınırken, döngüsel MP veya kalsiyumu etkinleştirmek için kariy bölgeye ultra flaş uygulanır.

Merhaba. Bugün size, kafes bileşiklerinin FE politikalarıyla birleştirilmiş patch clamp kayıtları için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, koku sensor nöronlarındaki cAMP kapılı kanalları ve kalsiyumla aktive olan kolin kanallarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Burada kullanılan patch clamp kayıt sistemi; ters mikroskop, bir perfüzyon sistemi, bir mikro manipülatör, bir kayıt elektrodu ve patch clamp amplifikatörünün kafa kademesine bağlı referans elektrodun tamamının bir Faraday kafesi içindeki titreşim önleyici masa üzerine monte edilmesini içerir. Patch clamp amplifikatörü, veri toplama yazılımına sahip bilgisayardaki bir dijitalleştiriciye bağlanmıştır. Yüksek şiddetli bir ultraviyole ışık flaşı oluşturmak için excelon flaş lambası kullanıyoruz.

Işık flaşı, elektrofizyolojik veri toplama işlemini kontrol eden yazılım kullanılarak bilgisayar tarafından veya manuel olarak tetiklenebilir. Fotoğraf deneyleri için en uygun dalga boyları, bir çıkış yuvasına veya flaş lambasına UV filtresi yerleştirilerek seçilir. Işık flaşının şiddeti, flaş lambasının voltajı veya kapasitansı değiştirilerek modifiye edilebilir.

Nötral yoğunluk filtrelerinin flaş lambasının ikinci çıkış yuvasına yerleştirilmesiyle ışık şiddeti üzerinde daha hassas bir kontrol sağlanır. Işık flaşı, kuvars fiber optik ışık kılavuzu aracılığıyla cam tabanlı kaplara ekilmiş nöronlara yönlendirilir. Işık kılavuzu, evirtilmiş mikroskobun epi-floresan aparatına bağlanır.

Bir adaptör kullanılarak, eksitasyon filtresi olmayan modifiye edilmiş bir filtre kübü, dikroik ayna aracılığıyla UV ışınlarını nörona yönlendirir. Işık, 100x yağ daldırma objektifi üzerinden odaklanır. Doku tarafından kaplanan alan, ışık kılavuzu bir aydınlatıcıya yerleştirilerek görselleştirilir.

Görüntü, mikroskoba bağlı bir CCD kamera aracılığıyla monitörden izlenir. Diseksiyondan önce, deneyler için UV et bölgesini yerelleştirmek amacıyla bölge kontrolü monitör üzerinde çizilir, conna a ve poly ile kaplanmış üç adet cam tabanlı kap hazırlanır. Diseksiyon hazırlığı için iki adet 50 mm'lik şeker kaplı Petri kabı ringer solüsyonu ile doldurulur.

Bunları buz üzerine yerleştirin. Ayrıca soğutun. Ardından 0.5 mililitre durdurma karışımı çözeltisi ile yaklaşık 10 mililitre Ringer çözeltisi içeren şırıngayı karıştırın.

İşleme sakrifiye edilmiş fare ile başlayın. Kafatasını çevreleyen deriyi çıkarın, çene hatları boyunca kesin ve başı gümüş kaplamalı bir petri kabına yerleştirin. Kabı stereo mikroskobun altına yerleştirerek bistüri ile sagital bir kesi yapın.

Baş bölgesini orta hat boyunca diseke edin. Başın yarısını medial taraf yukarı gelecek şekilde çevirin. Terminalleri açığa çıkarmak için septumu dikkatlice çıkarın.

Burada, bistüri ve 3 numara pens kullanılarak septumun çıkarıldığı büyütülmüş bir görüntü gösterilmektedir. Yağ epitelinin bulunduğu uç kısımları dikkatlice çıkarın. 55 numara süper ince pens ve bistüri kullanarak başka bir gümüş kaplama Petri kabına aktarın.

Refaktör epitel parçalarını alttaki terminallerden ayırın. Olfaktör epitel parçalarını bir mililitre sıfır divalent ringer solüsyonu içeren bir tüpe aktarın. Ardından papa instein ekleyin.

Mikro makaslar kullanılarak epitel oda sıcaklığında üç dakika boyunca inkübe edilir ve ardından mikro makaslarla tekrar nazikçe işlem yapılır. Beş dakika daha beklendikten sonra, geniş ağızlı ve ucu alevle pürüzsüzleştirilmiş bir past pipet kullanılarak durdurma çözeltisi içeren bir tüpe aktarılır; beş dakika santrifüj edilir ve süpernatan uzaklaştırılır. Yaklaşık 1 mL filtreli ringer çözeltisi eklenir ve yaklaşık 1 mm çapında ağza sahip, ucu alevle pürüzsüzleştirilmiş bir past pipet ile nazikçe aspire edilir.

Hücreleri içeren çözeltiyi üç adet cam taban petri kabının merkezine yerleştirin ve hücrelerin dört derece Celsius'ta yaklaşık bir saat boyunca çökmesini bekleyin. Ardından ringer çözeltisi ekleyin.

Kafes bileşiklerinin ortam ışığı nedeniyle bozulmasını önlemek için loş ışıkta çalışın. 100 x objektife bir damla imersiyon yağı uygulayın. Dissosiye edilmiş oratory duyusal nöronlar içeren bir cam tabanlı petri kabını, ters mikroskop parfümü sahnesine yerleştirin.

Ringer çözeltisi ile. Hücre içi çözelti içeren şırıngayı alüminyum folyo ile ışıktan koruyun ve soğutucuda saklayın. Siliya yapısı sağlam olan izole bir olfaktör duyusal nöron arayın.

Cary bölgesini monitörde çizili olan alanın içine konumlandırmak için mikroskop tablasını hareket ettirin. UV flaş alanını belirlemek için, kafes bileşiği içeren hücre içi çözelti ile bir yama pipetini doldurun. Pipeti, Apache klempli amplifikatörün baş ünitesi tutucusuna yerleştirin.

Standart yama kenetleme (patch clamp) teknikleri kullanılarak; bir yama pipeti ile nöronun somasına yaklaşın ve giga sızdırmazlık (giga seal) sağlayın. Ardından, bilgisayar üzerinden tüm hücre (whole cell) moduna geçiş yapın.

Bir stimülasyon protokolü başlatın ve yanıtı kaydedin. Tipik bir stimülasyon protokolü, voltajı sabit bir değerde tutar ve kafes bileşiğinin lizi için bir UV flaşının salınımını tetikler. Şimdi size bazı temsilci kayıtlar göstereceğiz; burada izole bir fare or fat duyusal nöronunun kafesli cAMP liziyle verdiği yanıt gösterilmektedir.

Üstteki ok, UV flaşının verildiği zamanı göstermektedir. Cycl MP tarafından aktive edilen akım, hücre dışı düşük kalsiyumlu ringer çözeltisinde -60 millivolt değerinde kaydedilmiştir. Akımın yükselme fazı hızlıdır ve tek bir eksponansiyel fonksiyon ile uydurulmuştur.

Burada, 1 mM kalsiyum içeren normal ringer çözeltisiyle yıkanmış aynı nörondan alınan bir kayıt görüyoruz. Akımın yükselen fazı ve -60 mV seviyesi çok daha düşük hale gelmiş ve çok fazlı bir görünüm kazanmıştır. Bu durum, kalsiyumun cAMP bağımlı klor kanallarına girerek sekonder bir klorür akımını aktive etmesinden kaynaklanmaktadır.

Bu örnekte, voltajı +60 milivolt düzeyinde sabitledik. Bu, kalsiyum girişini azaltmanın bir başka yoludur. +60 milivoltta cyclone PN kafeslemesinin neden olduğu yanıtın yükselme fazı, tek bir akım bileşeninin varlığını gösteren tek bir eksponansiyel ile iyi şekilde tanımlanmıştır.

Cilia içindeki kalsiyumun foto-salınımı ile elde edilen yanıtların bir örneği gösterilmiştir; bu akım klorür iyonları tarafından taşınmaktadır. Voltaj -50 millivolt idi. Artan şiddetteki UV flaşları ile kafes kalsiyumun foto-salınımı yoluyla artan genlikte yanıtlar indüklenmiştir.

Bu prosedürü uygularken disosiye fabrika duyusal nöronlarından nasıl kayıt yapılacağını size göstermiş olduk. Çok sabırlı olmanın önemli olduğunu unutmayın. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneyinizde başarılar dileriz.