Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

Bu deneyin genel amacı, vasküler implantları otolog kan kaynaklı endotelyal progenitör hücrelerle ekmek ve ardından bu tedavinin büyük bir hayvan modelindeki tromboz üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu işlem, geç büyüme gösteren porcine endotelyal progenitör hücrelerini izole etmek için domuzlardan periferik kan örneği alınarak gerçekleştirilir. Ardından, implante edilebilir bir cihaz.

Kavram kanıtlama çalışmamızdaki titanyum tüp, otolog PC'ler ile yerleştirilmiştir. Cihaz daha sonra domuzun vena cava inferior'una implante edilir. Sonuçlar, EPC yerleştirilmiş titanyum tüpün açıklığına dayanarak, kontrol grubu ve tıkanmış çıplak metal tüpün aksine tromboze karşı koruma olduğunu göstermektedir.

Duke cerrahi birimi, çığır açan ve yenilikçi araştırmaları teşvik etmeye kendini adamıştır. Aşağıdaki sunum, tıbbı ilerletmek için departmanlar ve disiplinler arası nasıl çalıştığımıza dair bir örnektir. Dr. EK, vasküler cihazların kanla temas eden yüzeyini hastanın kendi öncül hücreleri ile kaplayarak trombozu önleyecek bir hücre yerleştirme teknolojisi geliştirmek amacıyla yürütülen bir araştırma çalışmasına liderlik etmektedir.

Bu hücreler, implantı alacak olan aynı hastalardan türetildiği için bağışıklık sistemi tarafından reddedilme riskini önlemiş oluyoruz. Başarımız ve burada açıklanan yöntemler, geniş bir ekip çalışmasının sonucudur. Cerrahi implantasyon; damar cerrahisi bölümünden Sean Gage, Duke tıp öğrencisi Whitney Lane ve şahsım tarafından gösterilecektir.

Şimdi, hücre ekim sürecini detaylarıyla anlatacak olan Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nden doktora öğrencisi Alexander Janssen'i takdim etmek istiyorum. Bir domuz modeline implantasyon işleminin hemen öncesinde, titanyum tüplerin kan kaynaklı endotel progenitör hücreler ile nasıl ekileceğini göstereceğim. Bu yöntem bir kavram kanıtı görevi görmektedir ve aynı temel prensipler, nitinol stentler ve mekanik dolaşım destek cihazları gibi diğer birçok implante edilebilir cihaza da uygulanabilir. EPC'ler, domuz kanının mononükleer hücre fraksiyonunun ekilmesiyle izole edilir ve genellikle yaklaşık yedi gün sonra ortaya çıkarlar.

Bunlar, tipik arnavut kaldırımı morfolojileriyle tanınabilirler. EPC'leri kültürde toplam 9 milyon hücreye ulaşana kadar genişletin. Hazırlanan EPC'leri, etiketleme sırasında ve sonrasında ışığa maruz kalmalarını sınırlamaya dikkat ederek, serumsuz ortamda iki kez durulayın.

Ardından hücreleri PKH 26 floresan etiketi ile kaplayın ve ne kadar çözelti uygulandığını kaydedin. Hücreleri oda sıcaklığında dört dakika boyunca inkübe edin. Bir dakika sonra boya çözeltisine eşit hacimde porsin serumu ekleyerek etiketleme reaksiyonunu durdurun.

Birleştirilmiş çözeltileri, tam büyüme ortamı ile bire bir oranda seyreltin. Ardından sıvıyı aspire edin ve hücreleri üç kez tam büyüme ortamı ile, ardından iki kez yıkama ve kalsiyum veya magnezyum klorür içermeyen DPBS ile durulayın. Sonrasında, kullanılan hacmi kaydederek hücrelerin üzerini tripsin ile kaplayın ve 37 °C'de inkübe edin.

Üç dakikalık inkübasyonun ardından, hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için mikroskopi kullanın ve ayrılmışlarsa, eklenen miktarın iki katı kadar tripsin nötralizasyon çözeltisi ekleyin. Tripsini durdurduktan sonra, hücre çözeltilerini tek bir tüpte birleştirin ve bir hemositometre ile hücre yoğunluğunu ölçün. Son olarak, hücre süspansiyonunu pelletleyin ve hücreleri en az 4,5 milliliters serumsuz besiyerinde yeniden süspande edin.

Domuz ameliyata hazırlandıktan sonra, ikinci meme bezleri setinden başlayarak 15 numara bistüri ucu ile orta hattı kesin. Elektrokoter kullanarak dikkatli bir şekilde sondan bir önceki sete kadar ilerleyin. Diseksiyonu abdominal fasyaya kadar derinleştirin.

Peritonu mosquito pens ile kaldırın ve Metzenbaum makasıyla dikkatlice girin, idrar kesesini dışarı çıkarın ve mesane duvarına 3-0 Vicryl ile bir büzgü dikişi (purse string suture) atın. Merkezinde küçük bir insizyon yapın ve insizyondan içeriye 16 French Foley kateter yerleştirin. Ardından, cerrahi sırasında idrar çıkışını saat başına kilogram başına en az bir mililitreye titrelemek için intravenöz sıvılar uygulayın.

Ardından, genişlemiş küçük bağırsağı dışarı çıkarın ve periton boşluğunun posterior kısmını açığa çıkarmak için iki adet bour cerrahi retraktör yerleştirin; keskin ve künt diseksiyon kullanarak IVC'yi tanımlayın. IVC'yi çevre dokulardan dikkatlice serbest bırakın. Ardından, damarı sağ renal arterden başlayarak IVC bifurkasyonunun proksimalinden distal uca kadar skeletonize edin.

IVC diseksiyonu sırasında aşırı dikkatli olunmalıdır çünkü IVC'deki çok küçük bir defekt bile hayvanın hızla kanamasına ve eksanguinasyonuna yol açabilir. IVC segmentinin tüm yan dallarını bağlayın; IVC bifurkasyonunun hemen proksimalindeki iki büyük posterior lomber venin diseksiyonu ve bağlanmasında özel özen gösterin. Posterior tarafta genellikle büyük bir lomber ven bulunur.

Bu veni serbestçe diseke edin ve damar loopları (vessel loops) ile kontrol altına alın. Şimdi cerrahi ile paralel olarak, bu prosedüre başlamadan önce implantı EPC'ler ile eklemeye başlayın. Titanyum tüp doku yerleştirme iskeleleri tamamen monte edilmiş ve steril alanda kullanıma hazır olmalıdır.

Gaz sterilizasyonlu titanyum tüp düzeneğini 5 cc'lik bir şırıngaya yerleştirin. Ardından, 5 cc'lik şırınganın pistonunu çıkarın ancak atmayın. Şırıngaya sabit bir kapak takın. Şırıngayı EPC süspansiyonu ile doldurmak için bir pipet kullanın.

Ardından pistonu geri takın. Kapağı çıkarın ve şırınganın uç kısmını, tam oturduğu noktaya kadar düzeneğin açık silikon hortumuna yerleştirin. Daha fazla ilerletmeden, hücre solüsyonunu başlığın üst kısmına ulaşana kadar yavaşça ilerleterek tüm hava kabarcıklarını giderin.

Ardından düzeneği bir Luer kapakla kapatın ve steril bir eldiven içerisinde bantla mühürleyin. Bu düzeneğin tamamını işlenmiş bir şırınga tutucuya yerleştirin ve 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Oturma odacıklarının düz olduğundan emin olmak için bir ölçer kullanın ve düzeneğin hafif rotasyonla inkübe edilmesini sağlayın.

IVC ligasyonunun hemen ardından, domuz başına kilogram başına 100 ünite heparin uygulayarak cerrahiye devam edin. Ardından, IVC'yi önce distalde IVC ve lomber ven üzerinde 45 derecelik bir açıyla, sonra da proksimalde klempleyin. Sonrasında, proksimal ve distal klempler arasında dört santimetrelik longitudinal bir venotomi gerçekleştirmek için 11 numara skalpel bıçağı ve pot makas kullanın.

IVC'deki tüm kanı boşaltın ve iç lümenini steril DPBS ile yıkayın. Hücrelerin kurumasını önlemek ve havayı tahliye etmek için EPC yerleştirilmiş implantı veya çıplak metal kontrolü IVC'ye yerleştirin. IVC'yi kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içeren DPBS ile doldurun.

Ardından venotomiyi 4-0 proline sürekli sütür ile kapatın ve IVC'deki havayı küçük bir miktar geri kanama yoluyla boşaltmak için proksimal klemplerden birini çıkarın. Kanamadan sonra, implantı yerinde tutmak için distal klempi çıkarın. Ven duvarından geçen PVC tübe içine bir tutucu sütür uygulayın.

Fasyayı, bir CT iğnesi üzerindeki OPDS ile kapatın. Cilt altı boşluğunu iki sıfır Vicryl ile sürekli dikişle kapatın. Ardından cildi zımbalayarak kapatın.

Ağrıyı önlemek için insizyon bölgesi boyunca deri altına 20 mililitreye kadar %0,25 Marcaine uygulayın ve yarayı gazlı bez ve tegaderm ile kapatın. Gerektiğinde deri altına flu Nixon ve oksimorfon verin. Anesteziyi sonlandırın ve domuz uyandığında, önümüzdeki yedi gün boyunca onu kafesine geri döndürün.

Antibiyotik profilaksisi olarak her 24 saatte bir atri uygulayın ve cerrahi işlemden önce uygulanan fentanyl yamasının toplam üç gün boyunca yapışık kaldığından emin olun. Üç gün sonra, yerleştirilmiş titanyum tüp implantlar çıkarıldı ve iç yüzeyler incelendi. 550 nanometre eksitasyon dalga boyu altında, bir başka tüpte floresanla işaretlenmiş hücrelerden oluşan konfluent bir tabaka bulundu.

Hücre sınırlarını görüntülemek için kesit hücreleri ek olarak bir trombosit endotelyal hücre yapışma belirteci ile boyanmıştır. Bu prosedürde çok çeşitli boyalar kullanılabilir. Buna karşılık, çıplak bir titanyum tüp implant, vena cava inferior'un protrombrotik düşük kayma ortamında tamamen tıkanır.

Görseller A ve C'de gösterildiği üzere, hücre yerleştirilmiş titanyum tüp görsel B'de görülmektedir ve pıhtı oluşmadan kalmıştır. Periferik kanla yapılan izolasyon prosedürümüzü takiben, EPC'ler kültürde ortalama yedi gün sonra ortaya çıkar. Cerrahi prosedür gerçekleştirilirken, IVC'yi hem dikkatli hem de nazik bir şekilde iskeletleştirmek çok önemlidir; çünkü IVC'de veya yan dallarında oluşabilecek en küçük yırtık bile domuzun kan kaybı nedeniyle ölmesine (eksanguinasyon) yol açabilir. Bu prosedürün ardından, trombozu önlemek için kanla temas eden diğer materyaller hızla endotelize olabilir.

Örneğin, EPC'lerimiz ile kaplanmış endotelyal vasküler stentler, kan damarı duvarının doğal astarını taklit eder ve gelişiminden sonra stent restenozunu ve trombozu önleyebilir. Hızlı görme teknolojimiz, ameliyathanede veya kateterizasyon laboratuvarında, intravasküler cihazların dakikalar içinde hastanın kendi kanından türetilmiş endotelyal progenitör hücrelerle kaplanmasına olanak tanıyacaktır. Böylece, uzun süreli exvivo kültüre gerek kalmayacaktır.

Cihaz üzerindeki süre minimize edilir ve teknoloji, klinik uygulamalara aktarılabilirlik açısından pratik hale gelir.