Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

Bu deneyin genel amacı, otolog kandan elde edilen endotelyal Progenitör hücreler ile vasküler implantları tohumlamak ve daha sonra bu tedavinin büyük bir hayvan modelinde tromboz üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu, geç büyüme domuz endotelyal progenitör hücrelerini izole etmek için domuzdan periferik bir kan örneği alınarak elde edilir. Sonra, implante edilebilir bir cihaz.

Prensip kanıtı çalışmamızdaki titanyum tüp, otolog PC'lerle birlikte oturtulmuştur. Cihaz daha sonra domuzun inferior vena kavasına implante edilir. Sonuçlar, kontrol ve tıkalı çıplak metal tüpün aksine, EPC oturmuş titanyum tüpün açıklığına dayalı olarak tromboza karşı koruma olduğunu göstermektedir.

Duke cerrahisi, çığır açan, yenilikçi araştırmaları teşvik etmeye kendini adamıştır. Aşağıdaki sunum, tıbbı ilerletmek için bölümler ve disiplinler arasında nasıl çalıştığımızın bir örneğidir. Dr.EK, vasküler cihazların kanla temas eden yüzeyini hastanın kendi progenitör hücreleriyle kaplayarak trombozu önleyecek bir hücre oturma teknolojisi geliştirmek için bir araştırma çabasına öncülük etmektedir.

Bu hücreler implantı alacak olan aynı hastalardan elde edildiğinden, bağışıklık sistemi tarafından reddedilmekten kaçınıyoruz. Başarımız ve burada açıklanan yöntemler, büyük bir ekip çalışmasının sonucudur. Cerrahi implantasyon, vasküler cerrahi bölümünden Sean Gage, Duke tıp öğrencisi Whitney Lane ve ben tarafından gösterilecek.

Şimdi, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nden bir doktora öğrencisi olan Alexander Janssen'i tanıtmak istiyorum, kendisi bizi hücre tohumlama sürecinden geçirecek Ayrıntılı olarak, bir domuz modeline implantasyondan hemen önce titanyum tüplerin kandan türetilmiş endotelyal progenitör hücrelerle nasıl tohumlanacağını göstereceğim. Bu yöntem, kavramın kanıtı olarak hizmet eder ve aynı temel prensipler, nitinol, stentler ve mekanik dolaşım destek cihazları gibi diğer birçok implante edilebilir cihaza uygulanabilir. EPC'ler, domuz kanının mononükleer hücre fraksiyonunun kaplanmasıyla izole edilir ve genellikle yaklaşık yedi gün sonra ortaya çıkar.

Tipik parke taşı morfolojileri ile tanınabilirler. EPC'leri kültürdeki toplam 9 milyon hücre sayısına genişletin. Hazırlanan EPC'leri serum içermeyen ortamda iki kez durulayın, etiketleme sırasında ve sonrasında ışığa maruz kalmalarını sınırlamaya dikkat edin.

Daha sonra hücreleri bir floresan etiketi, PKH 26 ile örtün ve ne kadar çözelti uygulandığını kaydedin. Hücreleri oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin. Bir dakika sonra boya çözeltisine eşit hacimde domuz serumu ekleyerek etiketleme reaksiyonunu durdurun.

Kombine çözeltileri bire bir tam büyüme ortamı ile seyreltin. Daha sonra sıvıyı aspire edin ve hücreleri tam büyüme ortamı ile üç kez durulayın, ardından iki yıkama ve kalsiyum veya magnezyum klorür içermeyen DPBS'yi izleyin. Daha sonra, kullanılan hacmi not ederek hücreleri tripsin ile kaplayın ve 37 santigrat derecede inkübe edin.

Üç dakikalık inkübasyondan sonra, hücrelerin ayrıldığını kontrol etmek için mikroskopi kullanın ve eğer öyleyse, eklenenden iki kat daha fazla tripsin nötralizasyon çözeltisi ekleyin. Tripsin, hücre çözeltilerini tek bir tüpte birleştirin ve hücre yoğunluğunu bir hemo sitometre ile ölçün. Son olarak, hücre süspansiyonunu peletleyin ve hücreleri en az 4.5 mililitre serum serbest ortamda yeniden süspanse edin.

Domuzu ameliyata hazırladıktan sonra, ikinci hafıza bezi setinden 15 numaralı neşter bıçağıyla orta hattı kesin. Cran, elektrokoter kullanarak sondan ikinci sete gizlice liderlik etti. Diseksiyonu abdominal fasyaya kadar taşıyın.

Peritonu sivrisinek forseps ile kaldırın ve mets andal makasla dikkatlice girin, idrar kesesini dışsallaştırın ve mesane duvarına üç oh Vicryl çanta ipi sütürü yerleştirin. Merkezinde bir bıçak kesisi yapın ve kesiye 16 French Foley kateteri yerleştirin. Daha sonra ameliyat sırasında idrar çıkışını saatte kilogram başına en az bir mililitreye titre etmek için intravenöz sıvılar uygulayın.

Daha sonra, küçük genişlemiş bağırsağı dışsallaştırın ve periton boşluğunun arka yüzünü ortaya çıkarmak ve keskin ve künt diseksiyon kullanarak IVC'yi tanımlamak için iki bour cerrahi ekartör yerleştirin. IVC'yi çevreleyen dokudan dikkatlice boşaltın. Daha sonra damarı sağ renal arter proksimalinden IVC distal egzersizin bifurkasyonuna kadar iskeletleştirin.

IVC diseksiyonu sırasında aşırı özen, çünkü IVC'deki çok küçük bir kusur bile hızlı kanamaya ve hayvan ligate'in kan kaybına neden olabilir. IVC segmentinin tüm yan dalları, IVC'nin bifurkasyonunun hemen proksimalindeki iki büyük posterior lomber venin diseke edilmesine ve bağlanmasına özel özen gösterir. Genellikle arka tarafta büyük bir bel damarı bulunur.

Bu damarı serbest bir şekilde inceleyin ve damar halkaları ile kontrol edin. Şimdi ameliyata paralel olarak, bu işleme başlamadan önce implantı EPC'lerle tohumlamaya başlayın. Titanyum tüp doku oturma iskeleleri tam olarak monte edilmeli ve steril bir alanda kullanıma hazır olmalıdır.

Gazla sterilize edilmiş titanyum tüp düzeneğini beş cc'lik bir şırıngada açın. Ardından pistonu beş cc'lik şırıngadan çıkarın, ancak şırıngaya sabit bir cazibe kapağı atmayın. Şırıngayı EPC süspansiyonu ile doldurmak için bir pipet kullanın.

Ardından pistonu değiştirin. Kapağı çıkarın ve şırınganın yem ucunu, tam oturana kadar tertibatın açık silikon borusuna sokun. Ancak, hücre çözeltisini başlığın tepesine ulaşana kadar yavaşça ilerleterek herhangi bir kabarcık çıkarmayın.

Ardından düzeneği bir yem kapağıyla kapatın ve steril bir eldivenle bantlayın. Bu düzeneğin tamamını işlenmiş bir şırınga tutucusuna yerleştirin ve 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Oturma odalarının düz olduğundan emin olmak için bir gösterge kullanın ve düzeneğin hafif bir dönüşle inkübe olmasına izin verin.

IVC'yi bağladıktan hemen sonra kilogram domuz başına 100 ünite heparin uygulayarak ameliyata devam edin. Daha sonra IVC'yi hemen IVC ve lomber ven üzerinde distal olarak ve ardından proksimal olarak 45 derecelik bir açıyla sıkıştırın. Ardından, proksimal ve distal klempler arasında dört santimetre uzunlamasına ven otomisi yapmak için 11 numaralı neşter bıçağı ve tencere makası kullanın.

IVC'deki kanı boşaltın ve iç lümenini steril DPBS ile yıkayın. Şimdi hücrelerin kurumasını önlemek ve havayı boşaltmak için EPC oturmalı implantı veya çıplak metal kumandayı IVC'ye yerleştirin. IVC'yi DPBS ile kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile doldurun.

Daha sonra ven otomisini dört oh prolin çalışan bir sütürle kapatın ve IVC'yi az miktarda geri kanama yoluyla havalandırmak için bir proksimal kelepçeyi çıkarın. Kanamadan sonra, implantı yerinde tutmak için distal klempi çıkarın. Damar duvarından geçen PVC boruya bir destek ipliği uygulayın.

Fasyayı bir CT iğnesi üzerinde OPDS ile kapatın. Deri altı boşluğunu iki o Vicryl koşusu ile kapatın. Ardından cildi kapalı bir şekilde zımbalayın.

Kesi bölgesi boyunca deri altından 20 mililitreye kadar% 0.25 Marcaine uygulayın ve yarayı ağrı için gazlı bez ve tegaderm ile örtün. Grip Nixon ve oksimorfonu gerektiği gibi deri altına verin. Anesteziyi bırakın ve domuz uyandığında, önümüzdeki yedi gün içinde kafesine geri koyun.

Atri'yi her 24 saatte bir antibiyotik profilaktik olarak uygulayın ve ameliyattan önce uygulanan fentanil yamasının toplam üç gün boyunca bağlı kaldığından emin olun. Üç gün sonra oturan titanyum tüp implantlar çıkarıldı ve iç yüzeyleri incelendi. 550 nanometre uyarma dalga boyunun altında, başka bir tüpte floresan olarak işaretlenmiş hücrelerden oluşan birleşik bir tabaka bulundu.

Bölüm hücreleri ayrıca hücre sınırlarını görselleştirmek için bir trombosit endotel hücre adezyon markörü ile boyandı. Bu işlemde çok çeşitli lekeler kullanılabilir. Buna karşılık, çıplak bir titanyum tüp implantı, inferior vena kavanın protrombotik düşük paylaşımlı ortamında tamamen tıkanır.

A ve C resimlerinde gösterildiği gibi, hücreye oturan titanyum tüp resim B'de gösterilmiştir ve pik kan ile izolasyon prosedürümüzü takiben pıhtısız kalmıştır. EPC kültürde ortalama yedi gün sonra ortaya çıkar Cerrahi işlem yapılırken, IVC'yi hem dikkatli hem de nazikçe iskeletleştirmek çok önemlidir, çünkü IVC'deki veya yan dallarındaki en küçük yırtık bile domuzun kan kaybına neden olabilir. Bu işlemi takiben kanla temas eden diğer materyaller hızla endotel yalanları ile trombozu önleyebilir.

Endotelyal vasküler stentler, örneğin, EPC'lerimizle kan damarı duvarının doğal astarını taklit eder ve stent yeniden darlığını ve trombozu önleyebilir. Hızlı görme teknolojimiz, intravasküler cihazların hastaların kendi kanından elde edilen endotelyal progenitör hücrelerle ameliyathanede veya kateterizasyon laboratuvarında dakikalar içinde kaplanmasına olanak tanır. Bu nedenle, uzun süreli exvivo kültürü.

Cihazın kendisinde zaman harcanması önlenir ve teknoloji klinik uygulamaya çevrilmek için pratik hale gelir.