Name: Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Öğrenin fare embriyonik motor nöronlarını lektin tabanlı izolasyon ve kültür yöntemiyle nasıl elde edeceğinizi. Bu teknik, sinirbilim ve hücre biyolojisi araştırmalarında yüksek saflıkta nöron kültürleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sandra Bargen Biz mükemmel teknik destek için teşekkür ederim. Bu çalışma Protein araştırma departmanı (PRD, TP A1.2 (RC ve TS) ve RUB Araştırma Fonu, Rektoratsprogramme tarafından desteklenmiştir. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) monoklonal antikorlar 39.4D5 ve F55A10 Gelişim Çalışmaları Hibridoma elde edildi Bankası (DSHB, Iowa City, IA).

Özel reaktifler için: Sekme bakın. 1. Listelenen tüm diğer reaktifler Sigma Aldrich alınan hücre kültürü kalitesinde. 1. Tabaklar / lamelleri PORN-H/laminin kaplama <ol><li> 150 mM borat tamponu pH 8.35, 0.5 mg / ml Poly-DL-ornitin hidrobromid (PORNO-H) çalışma çözeltisi hazırlayın. <ol><li> 50 mg PORNO / 1 ml borat tamponu bir stok solüsyonu, önceden hazırlanmış ve -20 ° C'de saklanabilir </li></ol></li><li> % 100 etanol içinde yanan cam lamelleri sterilize edin ve onları hava kurumaya bırakın. </li><li> Kapak 4 geceleme yeterli PORNO-H çözümü ile yüzey ° C </li><li> Ertesi gün, sterilize edilmiş su ve hava-kuru lamelleri ile üç kez yıkayın. </li><li> HBSS 2.5 mikrogram / ml laminin çalışma çözüm hazırlayın <ol><li> Alikot -20 ° C'de saklanabilir. 4 ° C, kullanımdan hemen önce çözülmesini sağlayın. </li></ol></li><li> Laminin çözüm PORNO-H-kaplı lamelleri yüzeyini kaplayan ve onları kullanana kadar oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> 2. Lektin arıtma plaka kaplama <ol><li> Steril su, pH 9,5 10 mM Tris bir çözüm hazırlayın. </li><li> Lektin (HBSS lektin (Sigma L9640) toz çözmek), son konsantrasyonu 10 mcg / ml ekleyin. </li><li> Kat 8 ml lektin çözüm ile 10 cm hücre kültürü çanak yüzey ve oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca inkübe izin. </li><li> Kadar HBSS HBSS ve mağaza ile plaka üç kez yıkayın. </li><li> 30mm KCl,% 0.8 (w / v) NaCl depolarizasyon çözüm hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize edin. </li></ol> 3. Motonöron kültür ortamı <ol><li> Çözülme at serum geceleme 4 ° C ve 55 inaktive ° C 30 dakika, 5 ml ve depoya Temsili miktar -20 ° C. Çözülme kısım doğrudan RT kullanmadan önce. </li><li> Mağaza -20 ° C'de 1 ml aliqouts B27 ilavesi Kullanmadan hemen önce RT B27 takviyesi çözülme. Donma ve çözülme döngüleri kaçının. </li><li> Kısım -20 ° C'de 0.5 ml alikotları ve mağaza içine glutamax ve 1:100 kullanın. </li><li> 10 mg / ml% 0,1 BSA ile sterilize su CNTF bir stok solüsyonu hazırlayın. -20 ° C'de muhafaza </li><li> , 2.5 ml at serumu, 1 ml B27-ek ve doğrudan kullanmadan önce 0.5 ml glutamax ile 46 ml neurobasal orta karıştırın. </li><li> 37 ° C'ye kadar nihai konsantrasyonu 10 ng / ml orta ve ön-sıcak orta CNTF ekle </li></ol> 4. Omurilik diseksiyonu <ol><li> E12.5 hamile bir fare Kurban ve embriyoların dikkatle çıkarın. Embriyoların tamamen karşılamak için yeterli RT HBSS ekleyin. </li><li> Baş ve kuyruk çıkarın ve ata biner gibi uzuvları ile embriyo arka tarafında bir yer. </li><li> Bir forseps ile embriyo saptamak ve diğer forseps ile dış deri kaldırmak. </li><li> Forseps altında delerek omurilik çıkarın ve omurilik her iki tarafta testere gibi hareketleri ile yukarı kaldırın. </li><li> HBSS ile yeni bir çanak izole spinal kord transferi ve dorsal tarafında omuriliğin merkezi kanal açmak. </li><li> Dorsal kök gangliyon omurilik içine meninksler kaldırarak çıkarın. </li><li> Buz üzerinde 1 ml HBSS ve mağaza ile dolu bir Eppendorf reaksiyon tüpünde lektin plaka başına 6 embriyolar kadar hazırlık yapılır kadar omurilik bel parçaları toplayın. </li></ol> 5. Lektin tabanlı arıtma tarafından motor nöronlar zenginleştirilmesi Not: sonraki adımlara başlamadan önce, burada son (adım 3) orta hazırlamak ve prewarm <ol><li> 4 100 ml HBSS, -20 ° C'de saklamak ve çözülme 1 g tripsin çözme ° C tripsin bir çözüm hazırlayın. </li><li> Mix 1g tripsin inhibitörü, 98 ml HBSS ve 2 ml, 1 M Hepes pH 7.4, 1 ml alikotları 4 ° C'de muhafaza edilmelidir </li><li> Bir hücre kültürü kaputu omurilik tüp transferi ve HBSS 700 ul dikkatli bir şekilde kaldırın. </li><li> 7.5 ul tripsin çözümü ve dikkatle tersini tüp ile karışımı ekleyin. </li><li> 37 8 dk boyunca gerçekleştirin trypsination ° C. </li><li> 30 ul tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyon durdurun ve 1000 ul pipet ucu ile dikkatli bir şekilde 10-15 kat daha fazla hücre agrega görünür olana kadar kadar pipet ve aşağı (çiğnemek). 20-200 ul pipet ve ilgili bir ipucu ile öğütme işlemi tekrarlayın. </li><li> HBSS dolu lektin plakasına hücre çözümü Pipet ve yavaşça plaka döndürerek hücrelere dağıtmak. </li><li> Lektin plaka titreşimsiz bir yüzey üzerinde RT 60 dakika tutun. Kontaminasyonu önlemek için üzerini kapatın. </li><li> HBSS çok hafifçe kaldırın ve plaka hücre parçaları ve bağlı / unattached hücreleri çıkarmak için önceden ısıtılmış HBSS dikkatle 4 kez yıkayın. </li><li> Hemen son yıkama adımdan sonra, plaka 500 ul depolarizasyon çözüm ekleyin ve 1dk için kuluçkaya yatmaktadır izin. </li><li> Lektin bağlı hücrelerin sallayarak dekolmanı kolaylaştırılması veplaka dokunarak. </li><li> Önceden ısıtılmış 2 ml kültür ortamı ve 15 ml şahin tüp transfer plaka doldurun. </li><li> Neubauer sayma odasına hücre sayısını sayın. </li><li> Plaka uygulamaya bağlı olarak uygun sayıda laminin kaplı lamelleri veya plakaları hücre. </li><li> 1. gün ve daha sonra her iki günde bir, eski orta% 50 dikkatli yedek bir orta alışverişi yapın. Önceden ısıtılmış, taze hazırlanmış yeni bir kültür ortamı her zaman kullanın. </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları: Embriyonik motor nöronlar E12 E14 için fare embriyoları elde edilebilir. Lomber spinal kord toplam hücre popülasyonunun% 2-3 motor nöronlar oluşur ve dorsal kök ganglion nöronlar de NTR pozitif P75 olarak, (lektin tabanlı preplating işlemine başlamadan önce bu hücrelerin kurtulmak için önemlidir. genel bakış için bkz: Şekil 1 ve Şekil 2). İkincisi, meninksler lektin tabanlı preplating prosedürü (Şekil 2 ve Şekil 3) düzgün bir şekilde çıkarılmalıdır gibi, aynı zamanda güçlü ekarte edilmelidir bölünen hücreleri içerir. Kötü durumlarda, bu hücrelerin kültür plakaları büyümek. Şekil 3B ve 3D temsili resimleri yapılmıştır prosedürleri yıkadıktan sonra (protokol adım 5.9) düşük hücre yoğunluğu hakkında bir izlenim verir. Kültürler embriyonik fare motor nöronlar genellikle beş ya da yedi gün kadar tutulur. Bu süre boyunca hücrelere maksimum uzunluğu (Şekil 4) neurites oluşturabilirsiniz. Neurite uzunlukları 8 plakaları üzerinde substrat kuvvetle bağlıdır. PORNO-H kapalı kültür yemekleri kaplı tipik substrat laminin. Motor nöronlar, su lizis 8 tarafından üretilen ekstraselüler matrisler gibi, aynı zamanda başka bir ya da daha az tanımlanmış yüzeylerde büyüyebilir . Suboptimal kaplama, neurite uzunluğu ve büyüme konisinin alanı vakalarında azalma ve hücre ölümü genellikle artar. Trofik destek kültür embriyonik fare motor nöronlar hayatta kalmak için çok önemli bir rol oynar. Trofik 6 desteği olmadan% 10 ila% 20 günde yedi damla başlangıçta kaplama hücreleri Survival. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ve Silier nörotrofik faktör (CNTF) en sık kullanılan faktörlerdir ancak diğerleri kadar [Lösemi inhibitör faktör (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF olarak hayatta kalma teşvik edebilir ), İnsülin-benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 embriyonik fare motor nöronlar hazırlanması için akış şeması. Şematik çizim fare embriyonik motor nöronlar izolasyonu ve kültürü için farklı adımları gösteriyor. Kısaltmalar: SC: omurilik; HBSS: Hanks dengeli tuz çözeltisi; MN: motonöron. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 E12.5 fare omurilik bel kısmının izolasyonu: E12.5 fare embriyo. Bir sonraki adım için, baş ve kuyruk kaldırılır ve vücudun dorsal yukarı konumda B: sırt-yukarı konumda embriyo yerleştirilir. Omuriliğin sol ve sağ Forseps konumunu embriyo gövdesi tespit. Bir daha sonra forseps, deri kesme ve diğer embriyo konumunu düzeltmek için kullanılır omurilik altında kesmek için kullanılan C: E12.5 fare embriyo izole spinal kord. Spinal kord (bel, göğüs, rahim ağzı) parçalar gösterilir. Omurilik, meninksler çevrili ve dorsal kök gangliyon kısmı hala onlara eklemek D: omurilik boyuna doğru merkez kanal açmak için sırt tarafında kesilir E: ventral tarafta meninksler basık omurilik çıkarılır. Not: çıkartılır iken, bel kısmı küçük bir kesim tarafından işaretlenmiş F: omurilik Yalnızca bel kısmı daha sonra başka prosedürler için alınır . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 E12.5 fare embriyoları lomber spinal kord Islet-pozitif hücrelerin belirlenmesi ve izolasyonu:. Islet-1 / 2 antikor embriyonik lomber spinal kord içinde etiket motonöron sütun (kırmızı ok) ve Hoechst etiketleri tüm bölüm içindeki çekirdekleri. Bir E12.5 lumar omurilik bölümünde Çapraz. E12.5 fare embriyoları, standart prosedürlere göre, 6 saat için% 4 paraformaldehid daldırma sabit fosfat tamponlu salin solüsyonu ile 3 kez yıkanır ve sakkaroz ile tedavi edildi. 20 mikron Cryosections Kriyostat ile alınmış ve bölümlerde standart prosedürlere 11 göre immunhistochemical boyama ele alındı. Bölümlerde eşya, daha sonra hücre çekirdeğinin lokalizasyonu için Hoechst ile etiketlenir. Notdorsal kök ganglion nöronlar yanı ve Islet-1/2-positive hazırlık prosedürü izolasyon prosedürü bu doku parçaları hariç B: E12 gelen etiketli Islet-1 / 2 (kırmızı ok) ayrışmış lomber spinal kord hücreleri. 5 embriyolar, sol ve sağ öncesi lektin tabanlı preplating sonra. Hücreleri tüm hücre çekirdekleri görselleştirmek için Hoechst ile zıt C: lektin tabanlı preplating önce ve sonra Islet-1/2-positive hücrelerin Niceleme: D bir gün sonra kültür E12.5 embriyolar Nkx6.1 etiketli motor nöronlar. Hücreler tüm çekirdeklerin cisualieze Hoechst ile zıt. Tüm hücrelerin% 90 Nkx6.1 olumlu olduğunu unutmayın. Kısaltmalar: SC: omurilik; MN: motonöron; DRG: dorsal kök ganglion. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 A ve B E12.5 fare motor nöronlar Karakterizasyonu. Zenginleştirilmiş lomber spinal motor nöronlar 0 gün (0div) in vitro ve in vitro (2div) 2 gün P75 NTR ifade E12.5 fare izole edilmiştir. Hücreler,% 4 paraformaldehid ile sabit ve daha sonra standart prosedürlere göre P75 NTR boyandı. Hücreler tüm çekirdeklerin görselleştirmek için Hoechst kullanarak zıt C: Zenginleştirilmiş motor nöronlar PORNO-H ve laminin kültür substrat olarak in vitro (5div) 5 gün sonra ve β-III-tubulin CNTF boyanmış varlığı. Not hücreleri uzun neurites büyüdü ve uzun (dallanmış) süreci ve bir veya daha kısa süreçler (akson ve dendritler) ile tipik motonöron morfolojisi gösterilecek. Kısaltmalar: MN: motonöron; div in vitro gün. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Lektin tabanlı preplating olmadan disosiasyon sonra </td></tr><tr><td> Toplam sayıda hücre / SC </td><td> Tripan mavi-pozitif hücrelerin [%] </td><td> Islet-1/2- pozitif hücrelerin [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995,0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889,4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Ortalama ± SD </td><td> 1.021.0 ± 147,1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Lektin-tabanlı preplating </td></tr><tr><td> Sonra hücrelerin sayısı preplating / SC </td><td> Tripan mavi-pozitif hücrelerin [%] </td><td> Islet-1/2- pozitif hücrelerin [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189,6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168,8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125,0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Ortalama ± SD </td><td> 161.1 ± 33.0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özellikle bu amaç için 3 farklı izolasyon prosedürleri sahne E12.5 fare embriyonik motor nöronlar için temsili izolasyon prosedürleri özeti. Sonuçları sayıların toplamı, ya da yüzde numaraları ± SD olarak verilmiştir. Kısaltma: SC: omurilik, SD: standart sapma. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-1 / 2 pozitif hücrelerin P75 kaydırma [%] </td><td> Lektin tabanlı [%] kaydırma Islet-1 / 2 pozitif hücrelerin </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Lektin tabanlı ve P75 tabanlı 1 kaydırma motonöron hücre sayıları karşılaştırılması. Yüzdesi numaraları ± SD olarak verilmiştir.

<ol><li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li>
<li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li>
<li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li>
<li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
<li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li>
<li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu lektin tabanlı preplating tekniğin avantajı NTR P75 tabanlı kaydırma işlemi daha az pahalı olduğunu ve lektin antikorlar daha kararlı. Şekil zenginleştirme listelenmiştir. 2 ve Tab. 1 yordam, benzer sayıda hücre arıtma sağlar ve bu hücrelerin bir kısmı olduğunu gösterir motonöron işaretleyici Islet-1 / 2 ifade eder. En kritik adım lomber spinal kord izolasyon prosedürü. Lektin tabanlı preplating tarafından aşağıdaki arıtma prosedürü için zarları ve DRG&#39;ler (Şekil 2) kaldırılması esastır. Bu doğru yönetilen varsa, hemen hemen tüm hücrelerin (temsili resim için bkz: Şekil 3a) P75 NTR ifade . Islet-1 / 2 ve P75 NTR büyük olasılıkla ifade arasındaki farkı nedeni lomber motor nöronlar farklı Islet-1 / 2 10 daha yüksek ve düşük seviyelerde ifade çünkü. Pozitif veya negatif hücreler (Çizelge 1) ile sıkı olduğu gibi düşük seviyelerde Islet-1 / 2 ifadesi bu durumda immuncytochemical boyama ve sonraki sayım dikkat kaçmış olabilir. Ayrıca, Tablo 1&#39;de açıkça hücrelerin geri dönüşümsüz hasar olduğunu gösteren sadece birkaç tripan mavi pozitif hücrelerin olduğu gibi, izole hücrelerin sağlıklı bir durum prosedürü hayatta olduğunu gösterir. Bu değiştirici prosedürü de embriyonik farelerden alınan karışık genotip litre tek embriyo ve bu nedenle motor nöronlar izolasyonu sağlar. Sonuç olarak, P75 NTR antikor 6 kaydırma işlemi için bu alternatif benzer olmasa bile olası uygulama aralıkları açısından aynı kapasiteleri ve fare embriyonik motor nöronlar için ucuz ve verimli bir alternatif bir arıtma yöntemi sağlar .

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornitin hidrobromid </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Cam lamelleri </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 veya 14mm </td></tr><tr><td> Lektin </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre kültürü çanak </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta yüzeyi </td></tr><tr><td> At serumu </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Her parti, MN kültür için test edilmesi </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> ¸ </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps </td><td></td><td></td><td> Paslanmaz çelik, 4 veya 5 </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin inhibitörü </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Hücre kültürü süpernatant </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Hücre kültürü süpernatant </td></tr><tr><td> Anti-P75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3 özel reaktifler ve ekipman Tablo.

fare embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve kültür

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motor nöronlar, erken embriyonik sinir sisteminin geliştirilmesi yoluyla postmitotic aşamalarında doğru gelişir ve daha sonra dendrit ve aksonlar büyümeye. Ifade Nkx6.1 spinal motor nöronlar 1 için benzersiz öncü hücreler olduğunu nöral tüp nöroepitelyal hücrelerin. Postmitotic motor nöronlar nihai konumuna doğru hareket ve sütunlar halinde 2,3 spinal kanal boyunca kendilerini organize rağmen. Tüm bu farklılaşmış ve konumlandırılmış motor nöronlar% 90&#39;dan fazlası transkripsiyon faktörleri Islet 1 / 2 ifade eder. Onlar, uzuvların kasları yanı sıra beden ve iç organlar innerve. Diğerlerinin arasında, motor nöronlar genellikle yüksek reseptörler beyin türevli nörotrofik faktör (BDNF) ve nörotrofin-3 (NT-3), tropomiyozin ilgili kinaz B ve C (TrkB, TrkC) ifade eder. Tropomiyozin ilgili kinaz A (TrkA) 4 verilmemektedir. Iki yüksek reseptörler yanı sıra, motor nöronlar düşük afinite nörotrofin reseptör P75 NTR ifade. P75 NTR olgun nörotrofinler bağlamak yüksek reseptörler daha tüm nörotrofinler benzer ancak daha düşük afinite ile tüm nörotrofinler bağlayabilirsiniz. Embriyonik omurilik içinde, P75 NTR sadece spinal motor nöronlar 5 ile ifade edilir. Bu büyük çoğunluğunun hücreleri çevreleyen hücreler 6 arındırmak için motonöron izolasyon teknikleri geliştirmek için kullanılır olmuştur. P75 NTR ekstrasellüler etki karşı özel antikorlar (kaydırma) yardımı ile Yalıtımlı motor nöronlar tek bir deney için kullanılan antikor miktarı yüksek kaydırma için kullanılan plaka boyutu nedeniyle pahalı bir yöntem olduğu ortaya çıktı. Çok daha ekonomik bir alternatif lektin kullanımı. Lektin özellikle P75 NTR yanı sıra 7 bağlamak için gösterilmiştir. Aşağıdaki yöntem yerine P75 NTR antikor preplating prosedürü için buğday tohumu agglutinin kullanarak alternatif bir teknik anlatılmaktadır. Lektin NTR P75 antikor karşılaştırılabilir lektin P75 NTR antikor ve saflaştırma dereceleri son derece ucuz bir alternatif. Embriyonik omurilik motor nöronlar bu yöntemle izole edilebilir, hayatta kalmak ve neurites dışarı büyümek.

Omurilik fare embriyonik motor nöronlar izole alternatif bir yol tarif edilir. Bu yöntem, lektin düşük afinite sinir büyüme faktörü reseptör p75NTR bağlamak için aslında dikkate alır. Bu lektin tabanlı preplating p75NTR karşı spesifik antikor ile benzer bir arınma sağlar.

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Omurilik motonöronları, erken embriyonik sinir sistemi gelişimi yoluyla postmitotik evrelere doğru gelişir ve ardından dendritler ile aksonlar uzatır.

Bu prosedürün genel amacı, zenginleştirilmiş fare embriyonik motor nöron kültürü elde etmektir. Prosedür, öncelikle gebe bir farenin sakrifiye edilmesi, embriyoların çıkarılması ve lomber omuriliğin diseke edilmesiyle başlar. Bir sonraki adım, omuriliğin enzimatik işlem ve süre aracılığıyla tek hücre süspansiyonuna ayrıştırılmasıdır.Bunu takiben, motor nöronları hücresel kalıntılardan ayırmak için lektin tabanlı saflaştırma işlemini gerçekleştirin. Ardından, toplam hücre sayısını tahmin ettikten sonra, hücreler önceden kodlanmış kaplara veya lamellere ekilir. Son adım, kültüre yoğunluğunu deneysel prosedüre bağlı olarak ayarlamaktır.Nihayetinde, kültüre edilen hücreler büyüdükçe, başarının bir göstergesi olarak tipik motor nöron morfolojisi gözlemlenebilir. Fare motor nöronlarının kültürleme hazırlığında farklı materyallerin, maddelerin ve solüsyonların test edilmesi esastır. Hücreler bu değişimlerin herhangi birine hassas tepkiler verebileceğinden, RNA veya protein izolasyonu için motor nöronlar yüksek yoğunlukta kültüre edilebilir.Ancak, hücrelerin trafik desteğinden bağımsız olarak hayatta kalmalarına yol açan aktif nöronal ağlar oluşturma olasılığı vardır. Bu nedenle, RNA veya protein analizi için hücrelerin düşük yoğunlukta kültüre edilmesi bazı durumlarda daha iyi olabilir; bu prosedürü Rebecca Conrad ve Terza Japan gerçekleştirecektir. Her ikisi de laboratuvarımızda lisansüstü öğrencidir.Bu prosedüre, pH 8.35 olan 150 millimolar bide tamponu içinde 0.5 mg/mL poly DL ornithine hydrobromide çalışma çözeltisini hazırlayarak ve çözeltiyi filtrasyonla sterilize ederek başlayın. Ardından, cam lamelleri %100 ethanol içinde alevle yakarak sterilize edin. Daha sonra lamellerin havada kurumasına izin verin ve lamel yüzeylerini yeterli miktarda porn H çözeltisi ile kaplayarak gece boyunca 4 °C'de bekletin; bir sonraki gün.Bunları sterilize edilmiş su ile üç kez yıkayın. Ardından havada kurumaya bırakın. Mililitre başına 2,5 mikrogram konsantrasyonunda çalışma çözeltisini hazırlayın.HBSS içindeki Laminin ile porn H kaplı lamellerin yüzeyini laminin çözeltisiyle kaplayın. Ardından, kullanana kadar oda sıcaklığında en az iki saat inkübe edin. Bir sonraki adım, sterilize edilmiş su ile pH 9.5 değerinde 10 millimolar triss çözeltisi hazırlamaktır.Çözeltiyi filtreledikten sonra, karışıma nihai konsantrasyonu 10 µg/mL olacak şekilde lektin ekleyin. Ardından, 10 cm'lik bir hücre kültür kabının yüzeyini sekiz mL lektin çözeltisi ile kaplayın ve oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, plakayı 3 kez HBSS ile yıkayın ve kullanıma kadar HBSS içinde saklayın.Ardından, 30 millimolar potasyum klorür ve %0.8 sodyum klorür ile depolarizasyon solüsyonunu hazırlayın. Daha sonra karışımı filtrasyon yoluyla sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın. Bu prosedüre başlamak için, at serumunu dört derece Celsius'ta gece boyunca çözdürün.Ardından 55 °C'de 30 dakika boyunca inaktive edin, beş mililitrelik porsiyonlar halinde alikotlayın ve alikotları -20 °C'de saklayın. Kullanmadan önce bir alikotu doğrudan oda sıcaklığında çözün, ardından B 27 takviyesini bir mililitrelik alikotlar halinde -20 °C'de saklayın.Kullanımdan hemen önce oda sıcaklığında çözdürün. Dondurma-çözdürme döngülerinden kaçınmak için glutamatı 0.5 mL'lik alikotlara ayırın ve -20 °C'de saklayın. Ardından, sterilize edilmiş su ve %0.1 BSA içerisinde 10 µg/mL CNTF içeren bir stok çözelti hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.Son olarak, 46 mililitre nörobazal medyumu 2,5 mililitre at serumu, bir mililitre B 27 takviyesi ve 0,5 mililitre glutamat ile karıştırın. Ortama final konsantrasyonu 10 nanogram/mililitre olacak şekilde doğrudan CNTF ekleyin. Karışımı 37 °C'ye önceden ısıtın.Bu aşamada, 12,5 günlük embriyonik gebe bir fareyi sakrifiye edin ve embriyoları dikkatlice çıkarın. Embriyoları tamamen örtecek şekilde oda sıcaklığında HBSS ekleyin ve bir embriyoyu mikroskop altına taşıyın. Ardından baş ve kuyruk kısımlarını çıkarın ve embriyoyu, uzuvları iki yana açık olacak şekilde sırtı yukarı gelecek şekilde yerleştirin.Ardından, embriyoyu bir pens yardımıyla sabitleyin ve diğer pensle dış deriyi çıkarın. Daha sonra, pensi omuriliğin altına sokup delerek ve omuriliğin her iki yanında testere benzeri hareketler yaparak omuriliği yukarı kaldırıp çıkarın. İzole edilen omuriliği, içinde HBSS bulunan yeni bir kaba aktarın.Omuriliğin dorsal tarafından merkezi kanal açın. Ardından, omuriliğin çevreleyen meningelerini çıkararak dorsal kök ganglionlarını uzaklaştırın. Daha sonra omurilikleri, bir mililitre HBSS ile doldurulmuş bir EOR reaksiyon tüpüne aktarın.Omurilik sindirimi için hazırlık tamamlanana kadar bunları buz üzerinde tutun. Omuriliklerin bulunduğu tüpü bir hücre kültürü davlumbazına aktarın. Ardından dikkatlice 700 µL HBSS'yi uzaklaştırın ve ardından, ekteki makalede açıklandığı şekilde önceden hazırlanmış olan %1'lik çözünmüş tripsin solüsyonundan 7,5 µL ekleyin.Tüpü dikkatlice altüst ederek karıştırın. 37 °C'de sekiz dakika boyunca tripsinizasyon işlemini gerçekleştirin. Ardından, 30 µL tripsin inhibitörü ekleyerek reaksiyonu durdurun; hücre agregatları görünmeyene kadar 1000 µL'lik bir pipet ucuyla 10 ila 15 kez dikkatlice pipetaj yapın.Ardından, işlemi 20 ila 200 µL'lik bir pipetle tekrarlayın. Hücre solüsyonunu HBSS ile doldurulmuş lektin plakasına pipetleyin ve plakayı nazikçe döndürerek hücreleri dağıtın. Kontaminasyonu önlemek için lektin plağının kapağını kapatın ve oda sıcaklığında, titreşimsiz bir yüzeyde 60 dakika boyunca bekletin.HBSS'yi çok nazikçe uzaklaştırın ve hücre fragmanları ile yapışmamış hücreleri temizlemek için plakayı önceden ısıtılmış HBSS ile dört kez dikkatlice yıkayın; son yıkama adımının hemen ardından plakaya 500 µL 30 mM potasyum klorür %0,8 sodyum klorür depolarizasyon çözeltisi ekleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin; lektine bağlanmış hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için plakayı sallayın ve hafifçe vurun. Plakayı iki mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Ardından içeriği 15 mL'lik bir falcon tüpüne aktarın.Hücre sayısını bir Neubauer sayım odası ile belirleyin. Ardından hücreleri laminin kaplı lamellere veya plakalara ekleyin. Birinci günde ve sonrasında her iki günde bir, eski ortamın %50'sini dikkatlice önceden ısıtılmış, taze hazırlanmış kültür ortamı ile değiştirerek besiyerini yenileyin.Burada gösterilen ortam, hücre çekirdeklerinin lokalizasyonu için herst ile işaretlenmiş embriyonik 12,5 lomber omurilik kesitidir. Ok, eyelet one two antikoru ile işaretlenmiş embriyonik lomber omurilik içindeki motor nöron kolonlarını göstermektedir. Eyelet one two ile işaretlenmiş disosiye hücrelere bir örnek.Embriyonik 12.5 embriyolardan alınan lomber omurilik hücreleri, lektin tabanlı ön ekim öncesi ve sonrası sırasıyla sol ve sağ panellerde gösterilmiştir. Lektin tabanlı ön ekim öncesi ve sonrası eyelet one two pozitif hücrelerin nicel sonuçları burada gösterilmektedir. Sıfırıncı ve ikinci günde zenginleştirilmiş motor nöronları gösteren bir örnek burada yer almaktadır; hücreler %4 paraformaldehit ile fikse edilmiş ve ardından P 75 NTR için boyanmıştır.Standart prosedürlere uygun olarak, kültür altlıkları olarak porn H ve laminate kullanılarak in vitro beş gün sonra tüm çekirdekleri görüntülemek amacıyla karşıt boyama yapılmıştır; CNTF varlığında beta three tubulin boyaması için hücreler uzun nöritler geliştirmiş ve bir uzun çıkıntı ile bir veya daha fazla kısa çıkıntı ile tipik motor nöron morfolojisi sergilemiştir. Motor nöronlar, tüm omurgalıların ve omurgasızların vücudunda merkezi bir rol oynar.Bu izolasyon, motor nöronların sağkalım mekanizmalarının analizi için son derece kullanışlıdır. İzole edilen hücrelerle, etkileşim halindeki diğer hücrelerin, proteinlerin ve karbonhidratların aktivitelerini seçici olarak analiz edebilir; bu hücrelerin sağkalımı ve nöral büyümesi üzerine farmakolojik maddeler uygulayabilirsiniz.

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını...

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Video, transgenik bir fare embriyosundan okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların izolasyonunu göstermektedir. Embriyo, kolay görselleştirme ve tanımlama için yeşil bir floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş motor nöronları eksprese eder. Motor nöronlar bir floresan mikroskobu altında cerrahi olarak izole edilir ve bir kültür ortamında tutulur.

Bir Fare Embriyosundan Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, fare embriyolarının dorsolateral telensefalonundan birincil serebral korteks hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için bir protokolü göstermektedir.

Fare Embriyo Dorsolateral Telenefalonlarından Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Video, fare embriyolarının orta beyninden dopamin nöronlarını izole etme ve kültürleme sürecini göstermektedir. İzole edilmiş ventral orta beyin tabanları enzimler kullanılarak ayrıştırılır. Elde edilen dopamin nöronları toplanır ve çok kuyulu plakalar içindeki mikro adalara aktarılır. Hücreler, mikro adaların içinde yüksek yoğunlukta tutmak için bir dopamin nöron ortamı ile inkübe edilir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarının İzolasyonu ve Kültürü

Bu enterik sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerin doğrudan çalışma için bir hücre kültür protokolü göstermektedir. Lamelleri bir nöron / glia karışık kültür, immünohistokimyasal elektrofizyoloji, bireysel nöron ve glia fonksiyonu incelemek için yeteneği sağlayan yetişkin fare myenterik pleksustan...

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.

Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Bu çalışma, primer okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların homojen hücre kültürlerini ortaya çıkarmak için bir protokol sunmaktadır. Bu kültürler, oküler ve spinal motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerinin karşılaştırmalı analizleri için kullanılabilir.

Prenatal Islmn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler

Öğrenin fare embriyonik motor nöronlarını lektin tabanlı izolasyon ve kültür yöntemiyle nasıl elde edeceğinizi. Bu teknik, sinirbilim ve hücre biyolojisi araştırmalarında yüksek saflıkta nöron kültürleri sağlar.

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Daha fazla video keşfet