İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Bu video, primer kültürlenmiş insan dokusundan karsinoma ilişkili fibroblastlar veya CAF'ler üretme prosedürünü açıklamaktadır. Fibroblast karsinomları, neoplastik hücreler ile stroma olarak adlandırılan kanserli olmayan bir bölmeden oluşan kompleks dokulardır. Tümörle ilişkili stroma; hücre dışı matris ve fibroblastlar, miyofibroblastlar, endotel hücreleri, perisitler ve lökositler dahil olmak üzere çeşitli stromal hücrelerden oluşur. Karsinoma ilişkili fibroblastlar, tümör içinde bulunan aktive olmuş fibroblastların bir özelliği olan miyofibroblastlar açısından zengindir.

Stromalar, tümör progresyonunu tetiklemede önemli bir rol oynar. Bunlar, öncelikle redüksiyon mammoplastisi ile elde edilen sağlıklı meme dokusundan primer insan meme fibroblastlarının izole edilmesiyle in vitro ortamda üretilebilir. Elde edilen doku, tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır, ardından viral transdüksiyon ile ölümsüzleştirilir ve GFP ile bir puramisin direnç geni ekspres edecek şekilde mühendislenir.

Hücreler daha sonra, immunodefisyent bir fareye insan meme karsinomu MCF-7 hücreleri ile birlikte deri altına ko-enjekte edilir. Enjekte edilen insan hafıza fibroblastları, tümör destekleyici CAF myofibroblastlarına dönüşecektir.

Ardından, ebeveyn hümör mamar fibroblastlar tümör ksenogreftlerinden ekstre edilir ve purmycin varlığında kültüre edilir. Deneyle oluşturulmuş CAF'lar veya expCAF'lar olarak adlandırılan sonuçtaki purmycin dirençli hücrelerin immünohistokimyasal analizi, başlangıçta mevcut olan normal insan mamar fibroblastlarının, tümör ksenogrefti içinde tümör oluşumunu teşvik etme yeteneği kazanmış CAF myofibroblastlarına dönüştüğünü ortaya koymaktadır. Bu tekniğin, meme kanseri hastalarından primer CAF'ların ekstraksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ko-implantasyon tümörü kullanarak insan meme fibroblastlarından deneysel olarak CAF'lar oluşturabilmemizdir.

Prosedürü gösteren genel model, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Kar ve laboratuvardaki doktora öğrencisi Ahmed Kar olacaktır. Redüksiyon mammoplastisinden çıkarılmış bir gram sağlıklı insan meme dokusu ile başlayın. Dokuyu birkaç kez PBS ile yıkayın, ardından dokuyu 15 santimetrelik bir petri kabına yerleştirin ve steril bir jilet kullanarak 1,5 milimetreküpten daha küçük parçalara ayırın.

Ardından, doku parçalarını, her yarım gram doku için 10 mL hücre ayrıştırma tamponu içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için jilet kullanın. Daha sonra maksimum hızda bir dakika boyunca vorteksleyin. Tüpü 37 °C'lik bir inkübatördeki sallayıcıya yerleştirin ve doku parçalarının 12 ila 18 saat boyunca sindirilmesini sağlayın.

Ertesi gün tüp vorteksinde hala çok sayıda sindirilmemiş doku parçası kalacaktır. Önce maksimum hızda, tüpü tezgah üzerine yerleştirin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalamadan inkübe edin. İnkübasyonun ardından, elde edilen stromal hücrece zenginleştirilmiş SUP süpernatanını yeni bir konik tüpe aktarmak için beş mililitrelik fizyolojik pipet kullanın.

Ardından stromal fraksiyonu 250 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, hücre peletini PBS içinde yeniden süspande edin ve ardından tekrar 250 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra peleti %10 FCS ile desteklenmiş DMEM içinde yeniden süspande edin ve 15 cm'lik bir petri kabına aktarın.

Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Sekiz ila 10 gün sonra, hücreler konfluen hale gelmelidir. Bu noktada hücreler hasat edilir ve uzun süreli saklama için dondurulabilir.

İzole edilen primer insan normal bellek fibroblastlarını ölümsüzleştirmek için, hem H turt ve GFP eksprese eden bir retroviral P MIG vektörü aktarın, hücreleri dört ila beş gün boyunca kültüre edin ve ardından akış sitometrisi kullanarak GFP pozitif hücreleri ayırın. GFP ile işaretlenmiş ölümsüzleştirilmiş fibroblast kültürüne, puromisin direnç genini kodlayan bir retroviral P babe puro konstrüktü aktarın. Hücreleri, bir mikrogram/mililitre nihai puromisin konsantrasyonu varlığında beş ila yedi gün boyunca kültüre edin.

GFP etiketli purimisinle dirençli ölümsüzleştirilmiş insan bellek fibroblastlarını izole etmek için. Ardından, fibroblastların GFP ve purimisin direncini kodlayan genlerin yatay transferine yol açabilecek aktif virüsler üretip üretmediklerini incelemek için. 2,5 × 10⁵ purimisinle dirençli ölümsüzleştirilmiş insan bellek fibroblastını altı santimetrelik bir Petri kabında iki gün boyunca büyütün.

Fibroblast koşullandırılmış ortamı, 0,45 mikron gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtresi ile toplayın ve süzün. Ardından, bunu 10,5 mouse fibroblast hücresine ekleyin ve virüs enfeksiyonu verimliliğini artıran 5 µg/mL protein sülfat varlığında 12 saat boyunca kültüre edin. 12 saat geçtikten sonra, ortamı %10 FCS ile desteklenmiş DMEM ile değiştirin ve iki gün daha kültüre edin.

Hücreleri floresan mikroskobu ile inceleyin. GFP virüsü ile enfekte edilmiş 10 T ve yarım hücre GFP pozitif olacaktır. Şimdi, hücreleri mililitre başına bir mikrogram ile tedavi etmek için besiyerini değiştirin.

Beş ila yedi gün boyunca purmycin uygulayın. Ardından, herhangi bir purmycinle dirençli tent ve yarım hücrelerin koloni oluşturup oluşturmadığını belirlemek için hücreleri floresan mikroskobu ile tekrar gözlemleyin. Ebeveyn purmycin dirençli GFP etiketli insan meme fibroblastları tarafından üretilen aktif virüsler aracılığıyla gerçekleşen yatay gen transferinin, çevredeki purmycin duyarlı fare hücrelerini ve karsinoma hücrelerini etkileyebileceğini unutmayın.

Tümör ksenograftı içinde purmycinle dirençli ve GFP pozitiftir. Bu durum, immunodeficient bir fareye enjekte edilmek üzere karsinoma ilişkili fibroblastları deneysel olarak üretmek amacıyla, tümör ksenograftından enjekte edilen GFP etiketli purmycin dirençli insan meme fibroblastlarının izole edilmesi sürecini engelleyebilir. Yeni mikro santrifüj tüplerinde, yeni hazırlanan insan meme hücre hattı ile insan meme karsinomu hücre hattı MCF seven RAs'yi tripsinizasyon ve sayım işlemlerini yaparak başlayın.

Enjeksiyon başına 400 µL kültür medyumunda, %50 matrigel ile birlikte 1×10⁶ mc77 RA insan meme karsinomu hücresini ve 3×10⁶ GFP etiketli puromisin dirençli ölümsüzleştirilmiş insan meme fibroblastlarını resüspande edin. Kontrol grubu olarak tüpleri buza yerleştirin.

Ayrıca, MCF yedi RA hücresi içermeyen aynı insan meme fibroblastlarını hazırlayın. Ardından, 27 gauge bir iğne kullanarak, calf fenotiplerinin intratümöral varyasyonunu incelemek için hücre karışımını immünodefisyent çıplak bir fareyle deri altına enjekte edin. Birkaç farklı tümör ksenograftından calf'ları ve kontrol fibroblastlarını izole edin.

Ardından, her bir karışımı her bir farenin sağ ve sol bölgelerine implante edin. Enjeksiyondan sonra tümör veya fibroblast ksenogreftlerinin 42 gün boyunca büyümesine izin verin. Tümör ksenogrefti içindeki fibroblastların inkübasyon süresi, tümördeki parental fibroblastlerde edinilen miyofibroblast fenotipine göre optimize edilmelidir.

Ötanazi uygulanmış fareden kalf veya kontrol fibroblastlarını ekstrakte etmek için, en az 0,5 gram xenograft dokusunu ve en az 0,1 gram fibroblast xenograft dokusunu ayrı kaplara yerleştirin. Ardından, dokuyu 1,5 mm³'ten küçük küçük parçalara ayırmak için steril bir jilet kullanın. Daha sonra, doku parçalarını hücre disosiasyon tamponu içeren 15 ml'lik konik bir tüpe aktarmak için jileti kullanın ve maksimum hızda bir dakika boyunca vorteksleyin; hücre süspansiyonunu 37 °C'de sürekli yavaş ajitasyonla üç saat boyunca inkübe edin ve hücre süspansiyonunu santrifüjleyin.

Süspansiyon halindeki hücreleri, tümörden veya fiberglas sano greftinden ayırmak için 5 dakika boyunca 250 ×g kuvvetinde santrifüjleyin. Hücre peletini PBS içinde yeniden süspande edin ve santrifüj işlemini tekrarlayın. Ardından, purmisinle dirençli parental insan meme fibroblastı kültürünü izole etmek için elde edilen hücre peletini %10 FCS ile desteklenmiş DMEM içinde yeniden süspande edin.

Tümörden veya fibroblastlardan elde edilen hücreler, 1 µg/mL puromisin varlığında, 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 15 santimetrelik bir Petri kabında yüzdürülür. Bu işlem, kontamine olmuş tüm karsinoma ve/veya fare hücrelerini ortadan kaldıracaktır.

Stromal hücreleri konflu olana kadar çoğaltın ve hücreleri dondurma medyumu kullanarak -80 °C'de saklayın. 42 günlük XP calf 1 veya kontrol fibroblast 1 hücreleri olarak adlandırılan sonuçlanan purmycin dirençli hücrelerin ölümsüz olduğunu ve GFP için pozitif olduğunu unutmayın. İnsan bellek fibroblastları, tümör progresyonu sırasında karsinoma hücreleriyle etkileşime girerek tümör zenograftı içindeki tümör destekleyici miyofibroblastik fenotiplerini artırırlar. 1 × 10⁶ MCF-7 RA hücresini ve 3 × 10⁶ 42 günlük P calf hücresini karıştırın.

1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpü içerisinde, %50 matrigel içeren 400 mikrolitre kültür ortamında bir hücreleri güç enjeksiyonu yapın. Ayrıca, exp calf bir hücrelerinin tümör destekleyici miyofibroblastik fenotiplerini daha da artırmak için, bir eppendorf tüpüne karsinoma hücreleri içermeyen, 42 günlük kontrol fibroblastlarından 3x10⁶ hücre hazırlayın. Bu hücrelerin karışımını CF seven RA hücreleri ile birlikte çıplak fareye deri altına enjekte edin. Gerektiğinde kontrol hücrelerini hazırlamak için, kanser hücreleri olmaksızın sadece kontrol fibroblastı bir hücrelerini de enjekte edin.

Tümör promoting myofibroblastic fenotipi geliştirmek amacıyla, exp C iki hücrelerini üretmek için exp calf bir hücrelerini tümör xenograftı içerisinde 200 günlük ek sürelerle inkübe edin. Ayrıca, kontrol fibroblast bir hücrelerini karsinoma hücreleri olmadan bir fareye enjekte ederek, exp calf iki hücrelerine karşı kontrol olarak kontrol fibroblast iki hücrelerini üretin; tümörleri çıkarın ve doku kültürü kaplarına yerleştirin.

Tümörü veya fibroblast seno greftini diseke ederek tek hücre süspansiyonuna ayrıştırın ve kültüre edin. Hücreleri, purmycin varlığında %10 F-C-S-D-M-E-M içeren 15 santimetrelik bir petri kabında, konfluen hale gelene kadar çoğaltın; ardından hücreleri tripsinizasyonla ayırın ve dondurma medyumu kullanarak -80 °C'de saklayın. Elde edilen purmycinle dirençli hücreler, 242 günlük exp calf two hücreleri veya kontrol fibroblastları two hücreleri olarak adlandırılmıştır. GFP etiketli exp calf two ve meme tümörü xenograftlarından çıkarılan kontrol fibroblastları two hücreleri, bu görüntüde gösterildiği gibi immünohistokimyasal olarak analiz edilmiştir; hücreler, insana özgü prolyl 4-hydroxylase, collagen one A, fibronectin, S 100, A four ve fibroblast yüzey proteini dahil olmak üzere mezenkimal belirteçler için güçlü pozitif boyanma göstermektedir.

Bu sonuçlar, bu hücrelerin insan kaynaklı olduğunu ve mezenkimal doğaya sahip olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, epitel hücreleri için bir belirteç olan sitokeratin, bu GFP pozitif fibroblastlarda beraberinde boyanmamıştır. Bu bulgular, EXP C two ve kontrol fibroblast iki hücrelerinin, başlangıçta fare ksenogreftlerine nakledilen parental insan meme fibroblastlarından kaynaklandığını göstermektedir.

Önemli bir bulgu olarak, kontrol fibroblast iki hücrelerine kıyasla, XP calf iki hücrelerinin çok daha yüksek bir sayısında alfa SMA ve hücre dışı matris glikoproteini tenasin C (her ikisi de miyofibroblast belirteçleridir) için pozitif boyanma görülmüştür. XP calf iki hücrelerinde, 42 günlük XP calf bir hücrelerinde gözlemlenene kıyasla daha yüksek oranda alfa SMA pozitif miyofibroblastların bulunduğu dikkate alınmalıdır. Bu veriler, yerleşik insan hafıza fibroblastlarının, tümör ilerlemesi sonrası gelişen tümör zenograftları içinde kademeli olarak calf miyofibroblastlarına dönüştüğünü göstermektedir.

Komplementasyon tümör ksenogreft modeli, tümör mikroçevresi üzerine çalışan araştırmacıların, normal fibroblastların kansere evrilme süreçlerini incelemelerinin önünü açmıştır. Fibroblastlar bu şekilde tanımlanır.