Name: Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin, sıçan pial arterlerinde östrojen reseptör-α'nın dijital immünofloresan mikroskobuyla görüntülenmesi için optimize edilmiş boyama tekniğini. Bu yöntem, sinirbilim ve hücre biyolojisi araştırmalarında güvenilir protein görselleştirmesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

National Institutes of Health R01-NR5339 hibe ve Sağlık Bilimleri R061LD üniformalı Hizmetleri Üniversitesi tarafından desteklenen bu proje için çalışma oldu.

1. İzolasyon ve Hazırlık pial Arterler <ol><li> Sıçan, anestezi eklemek ve 1 1X PBS içinde% Evans mavisi ile bir arter ve serpmek içine bir kateter güvenli iken. Pial damarların daha kolay izole Evans mavi boya ile leke. </li><li> Gerekli ° C kadar -70 beyin ve mağaza ayıklayın. Optimal, beyinleri, artık 2 ay daha saklanmalıdır. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarak beynin yüzey pial arteriyollerin (ortalama çapı 35-50 mikron) çıkarın. Dikkatlice ince uçlu forseps kullanarak korteksin dorsal ve lateral yüzeyinden tüm mavi lekeli arteriyollerin çekin. Fiksatif yerleştirmeden önce aşırı yapışık kortikal doku çıkarın. </li><li> % 2 0.1M PBS içinde 30 dakika süreyle soğuk paraformaldehid hasat arteriyollerin sabitleyin. </li><li> Kesit için arteriyollerin hazırlamak için disk donma / mandren (-20 ° C'de) gömme orta dökün. </li><li> Chuck düz Place arteriyol bölümünde And dondurmak için bekleyin. Size dönük olacak şekilde arter ucu ile medya gömme Kriyostat dondurma diskte sıkıca geminin yere kadar doğru. Cımbız ile sağlam donmuş kadar tutun. </li><li> Kriyostat kafasının içine gemi ile donma disk yerleştirin ve Kriyostat ile 8 mikron pial arteriyol halkaları kesmek. </li><li> Krom-potasyum-jelatin Altyazılı slayt Mount arteriyol bölümleri. </li><li> 4 ° C gecede hazırlanan slaytlar slayt kutusunda buzdolabında saklayın. </li></ol> 2. ER-α Immunofluorescent Boyama 1. Gün <ol><li> Slaytlar buzdolabından çıkarın, oda sıcaklığında her getirmek. </li><li> Slaytları yıkamak için 1-1.5 ml 0.1M PBS (tüm bölümleri kapsayacak şekilde), 10 dakika boyunca oturup, drenaj ve iki kat daha fazla işlem tekrar dökün. Slayt her kenarı hidrofobik bir belirteç vardır. Sonuç olarak, slayt yüzeyinde sıvı kalır. Her yıkama sıvı dökülürve taze 0,1 M PBS ile değiştirilir. </li><li> Endojen floresan azaltmak için 50mm amonyum klorür 30 dakika oda sıcaklığında 1 ml slaytlar inkübe edin. </li><li> 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 'de açıklandığı gibi </li><li> % 0.1 Triton-X 100 artı, 30 dakika süreyle PBS% 1 normal keçi serumu (NGS) Blok slaytlar. non-spesifik bağlama azaltmak için. </li><li> Örnekleri PBS +% 0.1 Triton-X geceleme 4 +% 1 NGS ° C; primer antikor (1:500 tavşan poliklonal anti-ER-α) ile inkübe </li></ol> 2. Gün <ol start="7"><li> Slaytlar buzdolabından çıkarın, oda sıcaklığında her getirmek. </li><li> 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 'de açıklandığı gibi </li><li> % 1 NGS karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat boyunca% 0,1 Triton-X100 + PBS Oregon Green 488 ikincil anti-tavşan ile inkübe edin. Bu adım, bir sonraki adımları karanlıkta yapılmalıdır. </li><li> 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 'de açıklandığı gibi </li><li> Ve altındantilated davlumbaz, 4 'yerine 1 damla, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) artı sonra montaj gemilerin medya ve numune üzerinden bir kapak slip yerleştirin. </li><li> Kapak kayma kenarları mühür Açık tırnak cilası sürün. Yaklaşık 24 saat sürer slaytlar, tamamen kuruyana kadar hareket etmeyin. </li></ol> 3. Dijital Floresans Görüntüleme <ol><li> Pial damar görüntüleme ER-α biz bir dijital kamera ile donatılmış 3 renk (mavi, yeşil ve kırmızı) için filtreler ile Nikon Eclipse 80i dijital floresan mikroskop kullanmak dilim için. </li><li> Lekeli pial damar kesimleri ile mikroskop altında hazırlanan slaytlar takın ve ilgi floresan ile işaretlenmiş alanları görselleştirmek için ayarlamak. Sonra x600 büyütme artış x100 büyütme başlayın. </li><li> Çoklu görünüm dönüştürmek için DAPI (mavi) ve hücre çekirdekleri (DAPI) ve Nikon Genişletilmiş Derinlik Odak yazılımı kullanarak ER-α (Oregon Yeşil) FITC (yeşil) kanalları görüntüleri yakalamak için fotoğraf makinesini kullanın2-D görüntü içine damar segmentlerinin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Biz flüoresan millerini kullanarak pial arter damarlarında lokalize östrojen reseptör-α ve reseptör dijital floresan mikroskobu kullanarak görselleştirme optimize. Reseptör, bir tavşan poliklonal primer antikor ve bir Oregon Green 488 etiketli ikincil antikor görüntü beynin yüzey izole pial arterlerde reseptörleri için kullanılan varlığını saptamak için. Ayrıca, nükleer bir leke (DAPI) hücre çekirdekleri tespit ve ER-α hücre cyotosol ve çekirdeğinde bulunan rapor beri çekirdeğinde bulunan reseptörleri tespit eğer belirlemek için kullanılmıştır. Buna ek olarak, birincil antikor özgüllüğü doğrulamak ve doğrulayıcı birincil antikor ikincil bağlayıcı doğrulamak için deneyler yaptılar. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Immunofluorescent ER-α için boyama (yeşil) ve kadın sıçan beyin izole bir pial arter halka DAPI (mavi) ile counterstaining. Şekil 1A, bazı intranükleer östrojen varlığını düşündüren Birleştirilen görüntülerin reseptör-a (ok). Şekil 1B ve 1C, Z-yığın görüntüler bir arada ER-α odaklı görüntü. Görüntüler x600 büyütme ve farklı düzlemlerde aynı geminin kesim halka. Oklar östrojen reseptör-α göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 kadın sıçan beyin izole bir pial arter halka kontrol grupları için Immunofluorescent boyama. Şekil 2D primer antikor olmadan geminin gösterir. Şekil 2E ikincil antikor olmadan (endotel tarafı boyunca notu farklı otofloresans) damar gösterir. Görüntüler x600 büyütme ve differe aynı geminin kesim halkant uçaklar.

<ol><li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+compounds%2C+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li>
<li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+actions+of+estrogens%3A+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li>
<li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+effects+of+oestrogen%3A+multiplicity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Parmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li>
<li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels%3A+regulation+by+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li>
<li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha%2C+but+not+-beta%2C+in+en+face+arterial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li>
<li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+my+antibody+staining+specific%3F+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li>
<li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+and+Circ%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li>
<li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li>
<li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li>
<li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEBJ+Abstracts%22%5BJournal%5D)">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxical.+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li>
<li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+immunoreactants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li>
</ol>

Ifade edilen görüşler yazarlarına aittir ve üniformalı Hizmetler Sağlık Bilimleri Üniversitesi, Savunma Bakanlığı, ya da Amerika Birleşik Devletleri hükümeti, resmi politika veya konumunu yansıtmamaktadır.

Daha önce, geçici global iskemik beyin hasarı sonrası vazodilatörler 7, 8 ve vazokonstriktörlere 9 yanıt olarak çapını değiştirmek için pial arter kapasitesi belirgin genç ovarektomize sıçanlarda depresif olduğunu gösterdi. Kronik östrojen replasmanı vazomotor yanıtları 7-9 geri yükler. Ayrıca, östrojen replasman gecikme, bize uzun süreli östrojen eksikliği cerebrovasculature ER-α yoğunluğu etkileyip etkilemediğini sorgulamaya yol açan pial arter vazodilatör kapasitesi 10 östrojen yararlı etkilerini tersine çevirir . Biz batı kronik östrojen tükenmesi yanıt ER-α ifade değişiklikleri değerlendirmek için blot ile birlikte immunofluorescent etiketleme kullanılması planlandı. Reseptörleri ayrık gruplar görselleştirme bazı zorluk vardı Çünkü biz burada göstermek yöntemi değiştirilebilir. Bu nedenle, bu çalışmada birincil hedefimiz ilk görsel optimize etmek için nispeten basit bir yöntem geliştirmek içinpial arteriollerde reseptörleri Ag + referans. Çeşitli raporlar ile anlaşma 6,11,12 biz problama doku tipi için ayarlamalar, örnek kalınlığı, gemi ER-α dağılımı yanı sıra non-spesifik bağlayıcı derecesi yapmak için gerekli bulundu. . Bizim metodumuz pial gemi dilimleri ER-α varlığı görselleştirmek için çok etkili. Ancak diğerleri bu yöntemlerin başarılı kullanımı, daha önce belirttiğimiz gibi antikorların özgüllük ve konsantrasyonları, faiz, fiksasyon ve engelleme protokolleri ve doku taşıma 12 proteinlerin hücre içi konumu son derece bağlıdır. Geminin hazırlıkları görselleştirme önce biz tüm bu değişkenler zaman geçirdim. Biz nasıl biz bu yazıda bazı yaklaşım ayarlamak için gerekli sermiştir. Optimal pial arteriyollerin ER-α görselleştirmek için yola çıkan ve bu birkaç zorluklar sundu.Birincisi, bir sıçan pial arter ortalama büyüklüğü 35-50 mikron arasında beyin yüzeyinden izolasyon ve çıkarılması biraz zor. Biz Evans mavi boya öncesi kurban etmek daha kolay damar diseksiyonu yapar perfüzyon bulundu. Evan mavi floresan etkileyebilir, ancak biz bu boya kullanılarak avantajı küçük dezavantajları fazla olduğunu hissediyorum. Protokolde gemilerin birkaç kez yıkanır. Bu gemilerin içinde kalan boya ve floresan boya olası etkilerini en aza indirir azaltır. Karşılaştığımız bir diğer zorluk pial damar segmentlerinin kalınlığı zor reseptörler açık görselleştirme yapılmış olmasıydı. Ayrıca, muhtemelen birçok hücre katmanları ER-α dağılmış olduğu gerçeğini nedeniyle, özellikle net görüntüler elde edemezler. Uzunlamasına damar dilimleri (diğerleri gibi) ile çalışan çalıştı, ancak montaj sırasında küçük pial boyutu nedeniyle gemilerin işlemek ve gemilerin sıkılmasını önlemek zorduhatta bir mikroskop kullanılarak slides on. Son olarak, başarılı bir Kriyostat kullanarak ve 8 mikron kalınlığında halkalar çapraz damar kesme tekniği değiştirilmiş. Halkalar kolay ve çeşitli bir slayt monte edilebilir. Bir kere biz, biz sonra gemilerin tespit Danseshatalb ve ark 11 tarafından önerilen doku dondurma ilk flaş etkinliğini test etmek üzere gerekli hissettim gemilerin satın aldı . Marjinal olarak daha az arka plan immünofloresan rağmen, biz de reseptörleri daha az yoğun görselleştirme reseptörlerinin daha zor hale boyanmış olduğunu kaydetti. Sonuç olarak, (genellikle 1-2 ay arasında) kadar gerekli tüm beyin dondurmak ve saklamak için ilk tercih. Daha sonra gemilerin açıklandığı gibi çekin ve gemilerin Kriyostat dilimleme önce düzeltmek. Burada göstermek gibi. Bir birincil ve ikincil antikor ayrı ayrı hem de denetimlerini çalıştırmak için gerekli bir adımözgüllük ve arka plan immünofloresan belirlemek için. Östrojen reseptör-α antikorları ile çalışmak zor olabilir. Reseptör boyanması başarı ile memnun önce Aslında, biz 3 farklı birincil antikorlar (1 monoklonal ve poliklonal 2) çalıştı. Kontrollerin bir parçası olarak, öncelikle birincil antikor yanı sıra ihmal birincil antikor özgüllük doğrulandı. Şekil 2D primer antikor olmadan geminin gösterir. Herhangi bir boyama ve sadece küçük bir arka plan sinyali vardır. Birincil antikor poliklonal olduğundan, bazı diffüz non-spesifik bir arka plan boyama vardır. İkincisi, biz birincil antikor eklendi, ancak ikincil antikor (Şekil 2E). Bir damarların endotel sınırları boyunca autofluoresence temsil eden güzel bir marj görebilirsiniz. Bu çalışma ile Dan ve iştirakçi 5 tutarlı. Ancak, ER-α temsil immünofloresan küçük noktaların, ne de granüler bir görünüm ref nesayısız reseptörlerinin varlığı lecting birincil ve ikincil antikorlar hem de birleşimi olmadan tespit edilebilir. Biz farklı bir desen damarların endotel kenarları boyunca autofluoresence kaydetti. ER-α antikor özgüllük onaylamak ve ikincil antikor birincil bağlar antikor özgüllük Bu bağımsız testler önemlidir. Sonuç olarak, diğerleri 4 gösterdiği gibi, 5 beyin kan damarları çok sayıda ER-α alt-tipi reseptörler içerir . Bizim ellerde, izole pial arterlerden 8μm kesit dilimleri hazırlanıyor reseptörlerinin boyama ve görselleştirme artırır. Geleneksel yöntemler örnekleri incelemek konfokal mikroskopi kullanın. Konfokal mikroskopi kalın kesitlerle seri optik bölümleri görüntülemek için kapasitesine sahip önemli bir yararı. Ancak, iyi bir konfokal mikroskop satın alma, çok pahalı olabilir. Genişletilmiş Derinlik (EDF) yazılımı kullanılarak, biz bulundu.ekipman maliyetleri azaltabilir. EDF ile floresan mikroskop kullanarak, net görüntüler elde edilir ve Z-yığınları kullanarak çeşitli düzeylerde pial arteriyel ER-α görselleştirmek mümkün. EDF yazılım önemli bir yararı, bir şekilde etkili görüntüleri 3 boyutlu bir resim oluşturmak için görüntü yakalama izin verir. Konfokal mikroskop ya da fonların bir tahsis yazılımı ile dijital floresan mikroskop satın almak için erişimi olmayan laboratuarlar için araştırmacının hedeflerine bağlı olarak pratik ve daha az maliyetli bir seçenek olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> EVANS MAVİ </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Doku-Tek Ekim Bileşik </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Amonyum klorid </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Normal Keçi Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER-α tavşan poliklonal antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon yeşil 488 keçi anti-tavşan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> O-11.038 </td></tr><tr><td> Vectashield montajorta DAPI ile floresans </td><td> Vektör Lab. </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

rat pial arteriollerde Östrojen reseptör-α dijital immunofluorescent mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Birçok vasküler reaktivite östrojen etkileri, östrojen reseptörleri 1, 2, 3 ile etkileşimi aracılığıyla . Iki alt türleri (östrojen reseptör-α ve β) mevcut olmasına rağmen, östrojen reseptör-α hem düz kas ve endotel hücreleri konfokal lazer tarama mikroskopisi 4 ile birlikte floresan boyama kullanarak pial arter segmentlerinin tespit edilmiştir. Ayrıca, ER-α çekirdekleri ve sıçan baziler arterler 5 sitoplazmasında yer almaktadır. Bol reseptörleri ve parlak floresan, ancak ayrık gruplar reseptörler açık görselleştirme olasılıkla pial damar segmentinin birçok hücre katmanları bulunan numaralar nedeniyle zordur. Ayrıca, immünohistokimyasal teknikler kullanarak çok sayıda rapor kötü konfokal mikroskopi ayrıntılı deneyler 6 çoğaltılması için kritik gereksinimleri ile eşleştirilmiş. Bu makalede amacımız t optimize etmek için basit bir tekniği tarif etmek içinER-α boyama ve görselleştirme, kadın sıçan beyinlerinde elde pial arteriyollerin kesitsel dilim kullanarak. Önce bir diseksiyon mikroskobu altında izole yüzey pial arterler kolaylıkla belirlemek için Evans mavi boya ile sıçan serpmek. Arterlerin 8 mikron kesitler dilim Kriyostat farklı gemi uçaklar daha net görselleştirildiği ince damar bölümleri elde etmek için sağlar. Küçük bir damar segmentinin kullanmak yerine gemi boydan boya kesen, endotelyal ve düz kas tabakaları daha kolay izleme bir avantaja sahiptir. Buna ek olarak, uzun derinliği yazılım 10-12 farklı damar uçakların net görüntüler üretir ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanımı daha az masraflı olan bir dijital immunofluorescent mikroskop kullanımı.

Bu makalenin amacı, dijital bir immunofluorescent mikroskop kullanılarak sıçan pial arteriyel dilim östrojen reseptör-α immunofluorescent algılama (ERα) optimize etmek için bir yöntem göstermektir.

Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Östrojenin vasküler reaktivite üzerindeki etkilerinin çoğu, östrojen reseptörleri 1, 2 ve 3 ile olan etkileşimler aracılığıyla gerçekleşir. İki alt tip mevcut olsa da (östrojen ...

Bu prosedürün genel amacı, dişi sıçan beyinlerinden elde edilen peel arteriyellerinin kesitlerini kullanarak östrojen reseptörü alfa'nın boyanmasını ve görselleştirilmesini optimize eden basit bir tekniği tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle Evan's blue boyası ile boyanmış peel arteriyellerinin beynin yüzeyinden çıkarılması ve kesim işleminden sonra bir kriyostat kullanılarak sekiz mikronluk halkalar şeklinde kesilmesiyle gerçekleştirilir. Enine kesitler lamlara monte edilir ve östrojen reseptörü alfa'ya karşı primer antikor ile inkübe edilir.Ardından, kesitler ikincil antikor ve dpi içeren montaj medyumu kullanılarak karşı boyama ile inkübe edilir. Son olarak, floresan işaretli kabuk damar segmentleri görüntülenir ve genişletilmiş derinlik odaklama yazılımı kullanılarak 2D görüntülere dönüştürülür. Nihayetinde, genişletilmiş derinlik yazılımına sahip bir Nikon immunofloresan mikroskobu kullanılarak kabuk arteriyoler östrojen reseptör alfayı gösteren sonuçlar elde edilebilir.Ben Dr. Marguerite Littleton Kearney. Bugün, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Neil Farani, östrojen reseptör alfa görselleştirmesini ve boyanmasını optimize etmek için basit bir prosedürü uygulamalı olarak gösterecek. Peel'de.Evans blue boyası ile perfüze edilmiş ve -70 °C'de saklanmış bir sıçan beyninden arterlerin izole edilmesi. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak beyin yüzeyindeki pial arterleri belirleyin ve ince uçlu pensler yardımıyla bunları çıkarın. Yapışmış olan tüm beyin dokularını dikkatlice temizleyin.Arterleri buz üzerinde küçük bir deney tüpüne yerleştirin. Arterleri 0,1 mole PBS içindeki %2 soğuk toz formaldehid ile 30 dakika boyunca fikse edin. Arterleri kesit almaya hazırlamak için, eksi 20 °C'ye ayarlanmış bir dondurma diskine gömme ortamı dökün.Bir arter kesitini çuğ üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve donmasını bekleyin. Tamamen donduğunda, arteri kriyostat dondurma diskindeki gömme ortamına dik olarak yerleştirin. Arterin ucunun öne baktığından emin olun.Arter, tamamen donana kadar cımbızla tutun. Arterin bulunduğu dondurma diskini kriyostat başına yerleştirin ve ardından sekiz mikron kalınlığında arteriyel halka kesitlerini doğrudan bir lam üzerine alın. Arteriyel kesitleri krom potasyum jelatine monte edin.Arteriyel halkaları düzeltmek için iki fırça kullanarak lamları alt kısımlarından destekleyin. Hazırlanan lamları, bir lam kutusu içinde buzdolabında dört derece Celsius'ta gece boyunca saklayın. Lamları buzdolabından çıkarın ve tezgah üzerinde oda sıcaklığına getirin.Lamları 1 ila 1,5 mililitre 0,1 molar PBS ile yıkayın. 10 dakika sonra PBS'yi süzün ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. Son PBS yıkamasından sonra, lamları bir mililitre 50 milimolar amonyum klorür içinde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Endojen floresan oluşumunu azaltmak için, daha önce açıklandığı gibi lamları 0,1 molar PBS ile 3 kez, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde yıkayın. Ardından, primer antikorun spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için lamları %0,1 Triton X 100 ve %1 normal keçi serumu içeren bir PBS çözeltisinde 30 dakika boyunca bloklayın.Bloklamadan sonra, slaytları bloklama solüsyonu içerisinde 1/500 konsantrasyonda seyreltilmiş ER alfa primer antikoru ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Slaytları buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına getirin. Bağlanmamış primer antikoru, 1 ila 1,5 mL 0,1% PBS ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayarak uzaklaştırın.Her seferinde, lamları bloklama solüsyonu içinde Oregon Green, 4 88 ikincil anti-tavşan antikoru ile oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası lamları 0,1 molar PBS ile her yıkama 10 dakika sürecek şekilde 3 kez yıkayın ve ardından havalandırmalı çeker ocağa taşıyın. Lamların üzerine DAP içeren bir damla montaj medyumu damlatın ve ardından örneğin üzerine bir lam kapatma camı yerleştirin. Kapatma camının kenarlarını mühürlemek için şeffaf oje sürün ve tamamen kurumasını bekleyin.Boyanmış damar segmentlerini içeren hazırlanan lamları mikroskobun altına yerleştirin ve floresan işaretli ilgi alanlarını görüntülemek için ayarlama yapın. Boyanmış ER alfa'nın görüntülenmesi, bu prosedürün en zor adımıdır. Reseptörlerin en net göründüğü damar kesit seviyesini bulun.100 kat büyütme ile başlayın ve ardından büyütmeyi 600 kata çıkarın. Hücre çekirdekleri için DPI ve DR alfa için ZI kanallarında görüntüleri yakalamak üzere kamerayı kullanın ve ardından damar segmentlerinin birden fazla görünümünü 2D görüntülere dönüştürmek için yazılım kullanın. Burada, ER alfa için immünofloresan boyama sonuçları yeşil renkte ve DPI ile karşı boyama şeklinde gösterilmiştir.Dişi sıçan beyninden izole edilmiş bir arter halkasındaki mavi renkte, birleştirilmiş görüntüler intranükleer östrojen reseptör alfa varlığını düşündürmektedir. Z-yığın görüntülerinin bir kombinasyonu kullanılarak, ER alfa immünofloresansının odaklanmış bir görüntüsü elde edilebilir; otofloresans değerlendirmesi için hem primer hem de sekonder antikor için negatif kontroller uygulanmalıdır. Sekonder antikor ile inkübe edilmemiş bir arterin endotel tarafı boyunca belirgin olan otofloresansa dikkat ediniz.Bu videoyu izledikten sonra, beyin yüzeyinden arteryollerin nasıl izole edileceğini, soyulacağını ve sekiz mikronluk kesit halkalarının nasıl hazırlanacağını kavramış olmalısınız. Ek olarak, floresan işaretli östrojen reseptörü alfa ile çalışmaya ve dijital immunofloresan mikroskop ile Nikon extended yazılımını kullanarak reseptörleri nasıl görselleştireceğinize aşina olmalısınız.

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale sıçan mezenter anjiogenezisi teşvik için basit bir model tanımlamaktadır. Modeli aşağı tek hücre düzeyine kadar tüm mikrovasküler ağlarının yüz görselleştirme tr sağlayan bir doku nispeten kısa bir süre boyunca kılcal filizlenmesi, damar alanı ve damar yoğunluğu dramatik artış üretir.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Vasküler hücre fonksiyonu, hücre içi habercilerin aktivitesine bağlıdır.  Burada tarif edilen, izole bir aortun bireysel endotel ve düz kas hücrelerinde fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin ölçülmesine izin veren bir ex vivo iki foton görüntüleme yöntemidir.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Burada, anjiyotensin II'nin iyot-125 etiketli bir analogu kullanılarak sıçan beynindeki anjiyotensin II Tip 1 reseptörlerinin lokalizasyonunu kantitatif, dansitometrik, in vitro reseptör otoradyografisi ile tanımlamak için bir protokol sunuyoruz.

Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Bu el yazması arteriyoller elektrofizyolojik, kalsiyum görüntüleme ve baskı myography çalışmalarda kullanılan fare retina üzerinden yalıtım için basit bir protokol açıklar.

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

Burada, doğrudan fare aort endotel hücrelerini gözlemlemek için immünofloresan boyama için bir protokol sıyoruz. Bu teknik, endotel hücrelerinin farklı akış desenlerinde hücresel ve moleküler fenotiplerini incelerken ve ateroskleroz gelişiminde yararlıdır.

Vasküler Endotel Hücrelerini Doğrudan Gözlemlemek Için En Yüz İmmünofloresan Boyama

Protokol, Crohn hastalığının tam doğrulanmış TNBS kaynaklı murine modelini ve parafine gömülü formalin-sabit kolon bölümlerinin immünororesansını kullanarak immünohistokimya ile östrojen reseptörlerinin görüntülenmesi için kullanılan yöntemleri sunar.

İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Yüksek kaliteli görüntüleme için mikroskop optik temiz tutulması önemlidir. Toz, parmak izleri, aşırı immersiyon ya da orta ya da mikroskop montaj, kontrast ve çözünürlük azalmaya neden olur. DIC lens yüzeylerde kirlenme ve çizilmelere karşı özellikle duyarlıdır. Bu protokol detayları mikroskop temiz tutmak için prosedür.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Öğrenin, sıçan pial arterlerinde östrojen reseptör-α'nın dijital immünofloresan mikroskobuyla görüntülenmesi için optimize edilmiş boyama tekniğini. Bu yöntem, sinirbilim ve hücre biyolojisi araştırmalarında güvenilir protein görselleştirmesi sağlar.

Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet