Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Bu prosedürün genel amacı, dişi sıçan beyinlerinden elde edilen peel arterlerin kesitleri kullanılarak östrojen reseptörü alfa'nın boyanmasını ve görselleştirilmesini optimize etmek için basit bir tekniği tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle beyin yüzeyinden Evan's blue boyası ile boyanmış peel arterlerin çıkarılması ve kesim sonrası bir kriyostat kullanılarak sekiz mikronluk halkalar şeklinde kesilmesiyle gerçekleştirilir. Kesitler lamlara monte edilir ve östrojen reseptörü alfa'ya karşı primer antikor ile inkübe edilir.

Ardından, kesitler dpi içeren montaj medyumu kullanılarak sekonder antikor ve karşı boya ile inkübe edilir. Son olarak, floresan işaretli peel damar segmentleri görüntülenir ve genişletilmiş derinlik odağı yazılımı kullanılarak 2D görüntülere dönüştürülür. Nihayetinde, genişletilmiş derinlik yazılımlı bir Nikon immunofloresan mikroskobu kullanılarak peel arteriyoler östrojen reseptörü alfa'yı gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Ben Dr. Marguerite Littleton Kearney. Bugün, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Neil Farani, östrojen reseptörü alfalarının görüntülenmesini ve boyanmasını optimize etmek için basit bir prosedürü uygulamalı olarak gösterecek. Peel'de.

Evan's blue boyası ile perfüze edilmiş ve -70 °C'de saklanmış bir sıçan beynindeki arterleri çıkarın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak beynin yüzeyindeki arterleri belirleyin ve ince uçlu penslerle bunları çıkarın. Yapışık olan beyin dokularını dikkatlice temizleyin.

Arterleri buz üzerinde küçük bir test tüpüne yerleştirin. Arterleri, 0.1 mole PBS içerisinde %2'lik soğuk toz formaldehit ile 30 dakika boyunca fikse edin. Arterleri kesite hazırlamak için, -20 °C'ye ayarlanmış bir dondurma diskine gömme ortamı dökün.

Bir arter bölümünü düz bir şekilde dondurma bloğu üzerine yerleştirin ve donmasını bekleyin. Tamamen donduktan sonra, arteri kriyostat dondurma diskindeki gömme ortamına dik bir şekilde yerleştirin. Arterin ucunun öne baktığından emin olun.

Arter, tamamen donana kadar cımbızla tutun. Arterle birlikte dondurma diskini kriyostat kafasına yerleştirin ve ardından sekiz mikron kalınlığında arter halka kesitlerini doğrudan bir lam üzerine alın. Arter kesitlerini krom potasyum jelatin üzerine monte edin.

Arteriyel halkaları düzeltmek için iki fırça kullanarak lamları altlamaya hazırlayın. Hazırlanan lamları bir lam kutusunda, buzdolabında dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca saklayın. Lamları buzdolabından çıkarın ve tezgah üzerinde oda sıcaklığına getirin.

Lamları 1 ila 1,5 mililitre 0,1 molar PBS ile yıkayın. 10 dakika sonra PBS'yi süzün ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. Son PBS yıkamasından sonra, lamları bir mililitre 50 milimolar amonyum klorür içerisinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Endojen floresansı azaltmak için, lamları daha önce açıklandığı gibi, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde 0,1 molar PBS ile 3 kez yıkayın. Ardından, primer antikorun spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için lamları %0,1 Triton X 100 ve %1 normal keçi serumu içeren bir PBS çözeltisi ile 30 dakika boyunca bloke edin.

Bloklamanın ardından, lamları bloklama solüsyonu ile 1/500 konsantrasyonda seyreltilmiş ER alpha primer antikoru ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Lamları buzdolabından çıkararak oda sıcaklığına getirin. Bağlanmamış primer antikoru, 1 ile 1,5 mL 0,1% PBS ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayarak uzaklaştırın.

Her seferinde, lamları bloklama solüsyonu içindeki Oregon Green, 4 88 sekonder anti-rabbit ile oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat inkübe edin; inkübasyon sonrası lamları 0,1 molar PBS ile her yıkama 10 dakika sürecek şekilde 3 kez yıkayın ve ardından havalandırmalı bir çeker ocak altına getirin. Lamların üzerine DAP içeren bir damla montaj medyumu damlatın ve ardından örneğin üzerine bir lam kapatma camı yerleştirin. Kapatma camının kenarlarını mühürlemek için şeffaf tırnak cilası uygulayın ve tamamen kurumasını bekleyin.

Boyanmış damar segmentleri içeren hazırlanan lamları mikroskobun altına yerleştirin ve floresan işaretli ilgi alanlarını görüntülemek için ayarları yapın. Boyanmış ER alfa'nın görüntülenmesi, bu prosedürün en zor adımıdır. Reseptörlerin en net göründüğü damar kesit seviyesini bulun.

100 kat büyütme ile başlayın ve ardından büyütmeyi 600 kata çıkarın. Hücre çekirdekleri için DPI ve DR alpha için ZI kanallarında görüntüleri yakalamak için kamerayı kullanın, ardından damar segmentlerinin çoklu görünümlerini 2D görüntülere dönüştürmek için yazılım kullanın. Burada, ER alpha için immünofloresan boyama sonuçları yeşil renkte ve DPI ile karşı boyama şeklinde gösterilmiştir.

Dişi sıçan beyninden izole edilmiş bir arter halkasında mavi renkte, birleştirilmiş görüntüler intranükleer östrojen reseptörü alfaya işaret etmektedir. Zack görüntülerinden yararlanarak, ER alfa immünofloresansının odaklanmış bir görüntüsü elde edilebilir; hem primer hem de sekonder antikorlar için otofloresans negatif kontrolleri gerçekleştirilmelidir. Sekonder antikor ile inkübe edilmemiş bir arterin endotel tarafı boyunca belirgin olan otofloresansa dikkat ediniz.

Bu videoyu izledikten sonra, beyin yüzeyinden arterlerin nasıl izole edileceği, soyulacağı ve sekiz mikronluk kesit halkalarının nasıl hazırlanacağı konusunda bilgi sahibi olmalısınız. Ayrıca, floresan işaretli östrojen reseptörü alfa ile nasıl çalışılacağı ve bu reseptörlerin dijital bir immunofloresan mikroskop ve Nikon extended yazılımı kullanılarak nasıl görselleştirileceği konusunda aşinalık kazanmış olmalısınız.