Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Bu prosedürün genel amacı, saflaştırılmış protein örneklerini negatif boyama elektron mikroskobu ile görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle örneği destekleyecek olan elektron mikroskobu ızgaralarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise negatif boyama solüsyonunun hazırlanmasıdır.

Ardından, numune elektron mikroskobu ızgarasına uygulanır ve negatif boyama yapılır. Son olarak, EM ızgarası bir elektron mikroskobuna yerleştirilir ve uygun optik koşullar altında görüntüler kaydedilir. Geleneksel parlak alan (brightfield) DEM görüntüleri, özelliksiz bir arka plan üzerinde dağılmış tekil makromolekülleri gösteren yüksek kontrastlı ve keskin detaylı görüntülerdir.

Negatif boyamalı elektron mikroskobisi, favori proteininizi görselleştirmenin basit bir yöntemidir. Saflaştırılmış proteininizile ilgili yapısal analizler veya diğer biyokimyasal ve biyofiziksel assayler için rutin bir analiz olarak kullanılabilir. Burada, elektron mikroskobisi için negatif boyamalı bir örneğin nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz.

Bazı adımların metin açıklamaları ve şekillerden öğrenilmesinin zor olması nedeniyle, bu yöntemin görsel gösterimi faydalıdır. Bir cam pipet kullanarak, suyla dolu büyük bir beherin yüzeyine tek bir damla kollodyon damlatarak başlayın. Kollodyon yayılırken, su yüzeyindeki tozları tutabilir.

Tozlu kollodyon plastik filmi kaldırın ve yerine yeni bir damla ekleyin. Ardından, 50 ile 100 arasında EM ızgarasını, parlak yüzeyleri aşağı gelecek şekilde, tek tek yüzen plastik filmin üzerine yerleştirin. Rutin negatif boyama için 400 mesh ızgaralar seçin ve 200 mesh ızgaralar seçin.

Eğim çifti görüntülerini toplamak için kullanılır. Izgaraların alanından biraz daha büyük, kırışmamış ve yavaş emici bir kağıt parçası seçin. Kağıdı ızgaraların üzerine yerleştirin ve kağıt tamamen ıslanana kadar bekleyin.

Kağıt suyu çok hızlı emmemelidir. Ucuz bir not defterinden alınan kağıt kullanıyoruz. Izgaralar artık plastik film ve kağıt arasında sandviç şeklinde yerleştirilmiştir.

Kağıdı bir Petri kabına yerleştirip yavaşça havada kurumaya bırakmak için bir pens kullanın. Kırışıklıklara yol açabileceği için daha hızlı kurutma yöntemlerinden kaçının. Laboratuvarımızda kullanılan karbon kaplama cihazı, bir Creston 2 0 8 C yüksek vakumlu turbo karbon kaplayıcıdır.

Creston film kalınlığı monitörü ile donatılmıştır. Monitör, karbon birikintilerine karşı hassas bir kuvars balans kullanır. Ancak, burada açıklanan protokol bu cihazı gerektirmez. Karbon kaplama makinesindeki karbon çubukları sivriltip yükleyerek başlayın.

Ardından, buzlu alanın yarısı kaplanmamış kalacak şekilde vakum gresi sürülen bir cam lam kaplanır. Karbon kaplama sonrası, lamın gresli bölgeleri karbon kaplamanın kalınlığını tahmin etmek için kullanılır. Izgaralı kağıdı, karbon kaplama cihazının çan kavanozu altındaki tablaya yerleştirin. Gresli camı konumlandırın.

Slaytı ızgaraların yanına kaydırın. Vakum odasını en az 10 micro tours değerine kadar pompalayın, aksi takdirde kıvılcımlar ızgarada çok sayıda büyük parçacık oluşturacaktır. Şimdi akımı çok yavaş bir şekilde artırın.

Karbon çubuğun sivri ucu aşırı derecede parlak hale gelecektir. Kaplama başladığında bunu çıplak gözle gözlemlemeyin; karbon kaplama arttıkça cam lamın rengi koyu griye dönecektir, akımı istenen karbon kalınlığında kesin ve vakum fanusunun şeffaflığını göz önünde bulundurun. Bu değerlendirmeyi yaparken, lamın koyuluğu karbon kalınlığına göre kalibre edildiğinde, bu yöntem daha maliyetli olan film kalınlığı monitörü kadar doğrudur.

İşlem tamamlandığında, vakum odasını havalandırın ve kaplanmış ızgaraları daha sonra kullanmak üzere çıkarın. İnce plastik tabaka, negatif boyalı görüntünün kalitesini etkilemeyecektir ancak işleme devam etmeden önce ızgaralar birkaç saat kloroformda bekletilerek temizlenebilir. Taze uranil format çözeltisi hazırlayın veya iki haftadan kısa süredir karanlıkta saklanmış bir çözelti kullanın.

Taze ve kaliteli çözelti sarı renklidir, pH değeri dört civarındadır ve çökelek içermez, oldukça temizdir. İşleme, karbon kaplı gridleri parlatmak için ticari olarak mevcut bir sistem kullanarak başlayın. Karbon kaplı gridleri boşaltın.

Ardından, bir parça perfilm üzerine iki adet 20 µL distile su damlası ve iki adet 25 µL taze idrar format çözeltisi damlası yerleştirin. Ters kuvvetli antikapiler pensler kullanarak, karbon kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde ışıkla boşaltılmış bir ızgarayı tutun. Kritik nokta, bu penslerin ızgaralardan sıvı emmemesidir.

Şimdi ızgaraya iki µL protein örneği uygulayın ve proteinlerin ızgara tarafından emilmesini bekleyin. Bu işlem genellikle 30 saniye sürer, ancak çok seyreltik örnekler daha fazla süre gerektirebilir ve bu durum tampon konsantrasyonlarını etkileyebilir. İşlem tamamlandığında, protein örneğini filtre kağıdı kullanarak kurulayın.

Ardından, ızgaranın yüzeyini kısa süreliğine bir damla suya değdirip birkaç saniye içinde kurulayarak iki kez yıkayın. Su ile temas ettikten sonra, ızgarayı bir damla boyaya değdirip hızlıca kurulayın. Aynı tekniği kullanarak, ızgaranın 20 saniye boyunca ikinci bir boya damlasıyla temas etmesini sağlayın.

Son olarak, gridi laboratuvar çeker ocağında veya tercihen EM oturumundan önce vakum altında hava ile kurutun; mevcutsa mükemmelleştirilmiş bir hizalama dosyası yükleyerek EM mikroskobunun hizalamasını kontrol edin, bu işlem cihazı neredeyse kusursuz durumuna geri getirmelidir. Şimdi EM gridini tek eğimli standart bir numune tutucuya yerleştirin. Ardından, tutucuyu sahneye yerleştirin.

Ardından pompalama döngüsünün tamamlanmasını bekleyin ve tutucuyu kolona yerleştirin. Şimdi iyi boyanmış bir örnek alanı aramaya başlayın. Minimum kontrast yöntemini kullanarak veya bir CC, D kamerası kullanarak ve canlı dördüncü boyut hesaplaması yaparak manuel odaklama yapın.

Güç spektrumunuz. Ardından, derin odaklamayı gerekirse ayarlayın, genellikle negatif 1,5 mikron olarak belirlenir. Boyama konsantrasyonu ızgara boyunca farklılık gösterebilir, bu nedenle beyaz kontrastlı proteinleri arayın.

Protein kontrastının siyaha döndüğü, lekelerin düzensiz olduğu veya pozitif boyanmanın gerçekleştiği alanlardan kaçının. Grid hazırlama ve negatif boyanmış örneklerin görselleştirilmesi için ana hatları belirlenmiş yaklaşım kullanılmıştır. Gösterim amaçlı olarak bilinen birkaç protein görüntülenmiştir.

Detaylarına ve keskin kontrastlarına dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, bir elektron mikroskobunda gözlemlenmek üzere negatif boyalı makromolekül örneklerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik yaklaşık dört saatte tamamlanabilir.

Bu prosedürün ardından, moleküler yapıları daha iyi anlamak için 3D rekonstrüksiyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.