Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Bu prosedürün genel amacı, saflaştırılmış protein örneklerini negatif leke elektron mikroskobu ile görselleştirmektir. Bu, önce numuneyi destekleyecek elektron mikroskobu ızgaralarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, negatif leke çözeltisini hazırlamaktır.

Daha sonra, numune elektron mikroskobu ızgarasına uygulanır ve negatif boyanır. Son olarak, EM ızgarası bir elektron mikroskobuna yüklenir ve görüntüler uygun optik koşullar altında kaydedilir. Geleneksel parlak alanlı DEM görüntüleri, yüksek kontrastlı ve keskin ayrıntılara sahiptir ve özelliksiz bir arka plan üzerine dağılmış tek bir makromolekülü gösterir.

Negatif leke elektron mikroskobu, en sevdiğiniz proteini görselleştirmenin basit bir yöntemidir. Yapısal analiz veya diğer biyokimyasal ve biyofiziksel testler için saflaştırılmış proteininizi incelemek için rutin bir test olarak kullanılabilir. Burada elektron mikroskobu için negatif lekeli bir numunenin nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz.

Bu yöntemin görsel gösterimi, bazı adımların metin, açıklamalar ve şekillerden öğrenilmesi zor olduğu için yararlıdır. Su yüzeyindeki büyük bir su kabına tek bir damla kolodion yerleştirmek için bir cam pipet kullanarak başlayın. Kolodion yayıldıkça, su yüzeyinden toz yakalayabilir.

Tozlu bir kolodion plastik filmi çıkarın ve başka bir damla ile değiştirin. Daha sonra, 50 ila 100 EM ızgarayı parlak tarafı aşağı bakacak şekilde yüzen plastik filmin üzerine birer birer yerleştirin. Rutin negatif leke için 400 gözenekli ızgara seçin ve 200 gözenekli ızgara seçin.

Eğim çifti görüntülerini toplamak için. Izgara alanından biraz daha büyük, yavaş emiciliğe sahip, kırışmamış bir kağıt parçası seçin. Kağıdı ızgaraların üzerine yerleştirin ve kağıt tamamen ıslanana kadar bekleyin.

Kağıt suyu çok hızlı emmemelidir. Ucuz bir not defterinden kağıt kullanıyoruz. Izgaralar şimdi plastik film ile kağıt arasına sıkıştırılmıştır.

Kağıdı yavaşça kuruması için bir Petri kabına yerleştirmek için bir çift forseps kullanın. Kırışıklıklara yol açabileceğinden daha hızlı kurutma yöntemlerinden kaçının. Laboratuvarımızda kullanılan karbon kaplama makinesi Creston 2 0 8 C yüksek vakumlu turbo karbon kaplayıcıdır.

Bir Creston film kalınlığı monitörü ile donatılmıştır. Monitör, karbon birikintilerine karşı hassas bir kuvars terazisi kullanır. Bununla birlikte, burada açıklanan protokol bu cihazı gerektirmez Karbon çubukları bir karbon kaplama makinesinde keskinleştirerek ve yükleyerek başlayın.

Sonraki kat, buzlu alanın yarısını kaplamasız bırakan vakumlu gresli bir cam slayt Karbon kaplamadan sonra, sürgünün yağlanmış bölgeleri karbon kaplamanın kalınlığını tahmin etmek için kullanılır. Izgaralı kağıdı, karbon kaplama makinesinin çan kavanozunun altındaki sahneye yerleştirin. Yağlanmış camı yerleştirin.

Izgaraların yanındaki kaydırın. Vakum odasını en az 10 mikro tura kadar pompalayın, aksi takdirde kıvılcım ızgarada birçok büyük parçacık oluşturacaktır. Şimdi akımı çok yavaş arttırın.

Karbon çubuğun keskin ucu son derece parlak hale gelecektir. Kaplama başladığında çıplak gözle gözlemlemeyin, karbon kaplama biriktikçe cam sürgü rengi koyu griye dönecek, akımı istenen karbon kalınlığında kesecek ve çan kavanozunun şeffaflığını hesaba katacaktır. Bu kararı verirken, sürgünün karanlığı karbon kalınlığına göre kalibre edildikten sonra, bu yöntem daha maliyetli film kalınlığı monitörü kadar doğrudur.

İşlem bittiğinde, vakum odasını havalandırın ve daha sonra kullanmak üzere kaplanmış ızgaraları çıkarın. İnce plastik tabaka, negatif lekeli görüntünün kalitesini etkilemez, ancak devam etmeden önce ızgaraları birkaç saat kloroformda bekleterek çıkarılabilir. Taze idrar L format solüsyonu yapın veya karanlıkta iki haftadan daha az bir süre saklanmış solüsyon kullanın.

İyi taze çözelti sarı bir renge, yaklaşık dört pH'a sahiptir ve çökelti olmadan çok temiz çalışır. Parlamak için piyasada bulunan bir sistem kullanarak başlayın. Karbon kaplı ızgaraları boşaltın.

Sonraki yer, iki adet 20 mikrolitrelik damla damıtılmış su ve 2 adet 25 mikrolitrelik damla taze pisuar format çözeltisi bir parça perfil üzerine. Ters kuvvet anti kılcal forseps kullanarak, karbon kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde parıldayan boşaltılmış bir ızgarayı tutun. Kritik olarak, bu forsepsler sıvıyı ızgaralardan sifonlamaz.

Şimdi ızgaraya iki mikrolitre protein örneği uygulayın ve proteinlerin ızgaraya emilmesini bekleyin. Bu genellikle 30 saniye sürer, ancak çok seyreltik numuneler daha fazla zaman gerektirir ve bu da tampon konsantrasyonlarını etkileyebilir. Bittiğinde, protein örneğini filtre kağıdı kullanarak kurulayın.

Ardından, yüzeyine bir damla suya kısa bir süre dokunarak ve birkaç saniye içinde kurulayarak ızgarayı iki kez yıkayın. Su kısa bir süre sonra ızgaraya bir damla leke dokundu ve hızlıca kurulayın. Aynı tekniği kullanarak, ızgaranın 20 saniye boyunca ikinci bir leke damlası ile temas etmesine izin verin.

Son olarak, ızgarayı tezgah çeker ocak üzerinde veya tercihen EM oturumundan önce bir vakumda havayla kurutun, varsa mükemmel bir hizalama dosyası yükleyerek EM mikroskobunun hizalamasını kontrol edin, mükemmele yakın duruma geri getirmelidir. Şimdi EM ızgarasını tek eğimli standart numune tutucuya yükleyin. Ardından, tutucuyu sahneye yerleştirin.

Ardından pompalama döngüsünün tamamlanmasını bekleyin ve tutucuyu sütuna yerleştirin. Şimdi iyi lekeli bir örnek alan aramaya başlayın. Minimum kontrast yöntemini kullanarak veya bir CC, D kamera kullanarak ve canlı dörtlüyü hesaplayarak manuel olarak odaklanın.

Güç spektrumunuz. Ardından derin odağı gerektiği gibi, genellikle negatif 1,5 mikrona ayarlayın. Leke konsantrasyonu ızgara boyunca değişebilir, bu nedenle beyaz kontrastlı proteinleri arayın.

Protein kontrastının siyaha dönüştüğü düzensiz leke veya pozitif leke olan alanlardan kaçının. Izgaralar oluşturmak ve negatif lekeli örnekleri görselleştirmek için özetlenen yaklaşımı kullanma. Gösteri amacıyla birkaç tanıdık protein görüntülendi.

Ayrıntılarına ve keskin kontrastlarına dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, bir elektron mikroskobunda gözlem için negatif lekeli makromolekül örneklerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık dört saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü takiben, moleküler yapıları daha iyi anlamak için 3D rekonstrüksiyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.