Name: Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Keşfedin küçük molekül indüksiyonu kullanarak pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak öncüler ve fonksiyonel kardiyomiyositler üretme yöntemini. Bu teknik kardiyovasküler onarım için yüksek verimli hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

XHP, Ulusal Sağlık (NIH), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIHK01AG024496) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (NIHR21HD056530) hibe Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. Çözüm ve Medya Hazırlık <ol><li> Jelatin kaplama çözümü:% 0.1 (w / v) 4 GKD 2 O, otoklava jelatin ve mağaza ° C </li><li> Matrigel kaplama çözümleri. Stok çözelti: 4 ° C gecede, 10 ml buz DMEM veya DMEM/F12 ekleyin, iyice karıştırın ve kısım 1 ml / tüp, steril doku kültürü kaputu altında -20 mağaza ° C. yavaş çözülme Matrigel (10 ml) Çalışma çözüm: yavaş çözülme 1 ml Matrigel kısım, 4 ° C 14 ml soğutulmuş DMEM veya DMEM/F12 1-2 saat, transferi ve kaplama hemen önce steril doku kültürü başlık altında iyice karıştırın. </li><li> İnsan laminin kaplama çözümü: seyreltik 1 ml insan laminin çözüm buz DMEM veya DMEM/F12 için (Tris 0.5 mg / ml -80 mağaza, NaCl Tamponlu ° C, 1-2 saat 4 ° C yavaş çözülme) 12.5 ml çalışma solüsyonu (40 mg / ml) steril doku kültürü başlık altında yer kaplama hemen önce. </li><li> Büyüme faktörü stok solüsyonları (500-1000X): 10 mg büyüme faktörü çözülürSteril tampon / ml (% 0.5 BSA, 1.0 mM DTT,% 10 gliserol, 1XPBS) ve -80 ° C 50-100 ul / tüp alikotları olarak depolamak </li><li> HESC medya: DMEM/F12 veya KO-DMEM (% 80), KO, serum değişimi (% 20), L-alanyl-L-gln 'ya da L-gln (2 mM), MEM aminoasitlerin (MNAA 1X) ve β-mercaptoethanol (100 mcM), filtre edilmiş ve 4 mağaza ° C, kullanmadan önce 20 ng / ml bFGF ile desteklenebilir. Veya tanımlanmış bileşenleri ile "KO serum yerine" yerine: DMEM/F12 veya KO-DMEM (% 100), L-alanyl-L-gln 'ya da L-gln (2 mM), MNAA (1X), MEM, esansiyel amino asitler (MEAA 1X) ve β-mercaptoethanol (100 mcM), filtre edilmiş ve 4 mağaza bFGF (20 ng / ml) ile desteklenmiş ° C, insan insülini (20 mg / ml), askorbik asit (50 mg / ml), insan aktivin A (50 ng / ml), insan albümin / Albumax (10 mg / ml), ve insan transferrin (8 mg / ml) Kullanmadan önce. </li><li> HESC kalp farklılaşma medya: DMEM/F12 (% 90), tanımlanan FBS (% 10) ve L-alanyl-L-gln 'ya da L-gln (2 mM). </li><li> Medya içeren nikotinamid (NAM): add NHESC medya veya 10 mM son konsantrasyon, 4 filtre, mağaza ° C ve 2 hafta içinde hazırlık kullanın. HESC kalp farklılaşma medya AM </li></ol> 2. Plakası Kaplama <ol><li> Coat tabak-jelatin: add ml / 6 kuyucuğu jelatin çözüm 2.5 ve 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör bir gece inkübe edin. </li><li> Coat laminin plakalar: chill jelatin kaplı plakalar ve jelatin kaldırmak, 2.5 ml / pre-soğuk, iyi Matrigel ya da insan laminin kaplama çalışma çözeltisi 4 ° C gecede 6 kuyucuğu ve inkübe jelatinize. </li></ol> 3. Tanımlanmış koşullar altında ayrım yapılmamış hESC Pasajlanması ve Yayımlamak <ol><li> HESC kolonileri 5-7 gün eski büyümesine olanak ve diseksiyon mikroskobu (önceden sıcak sahne diseksiyon 37 ° C) sterilize kaput diseksiyon altında hESC kültür plaka almak. </li><li> HESC koloniler bölünebilir seçin. Morfolojik, bu koloniler (sm&gt;% 75 farklılaşmamış hESC olmalıdırgenellikle hafif opak kenarı ile diseksiyon mikroskobu altında tanımlanan tüm kompakt hücreleri), (beyaz tüylü-up hücreleri, açık diferansiye hücreler). Dikkatle seçilen koloniler anahat ve P2 steril pipet ucu kenarı ile koloni veya cam kapiller çekti (varsa) koloni çevreleyen farklılaştırılmış fibroblast tabakası ve tüm farklılaşmış parçaları kaldırmak. </li><li> Aspire kayan müstakil farklılaşmış hücre içeren eski medya çıkarın. Bir kez hESC medya (bFGF olmadan) ile yıkayın. Ekle / 3 ml 20 ng / ml bFGF içeren taze hESC medya. </li><li> Farklılaşmamış hESC koloniler küçük parçalar halinde kesin, ve steril pipet veya kapiller çekti cam ile ayırmak. </li><li> 50 ml konik boru birlikte müstakil koloni parçaları içeren medya Havuzu. 1 ml / birlikte 20 ng / ml bFGF ve havuz içeren iyi hESC medya plaka ile bir kez yıkayın. </li><li> Taze kaplı plakalar Matrigel veya insan laminin çözüm aspire. Kısım 4 ml / h6 plaka koloni parçaları içeren ESC medya. Hafifçe sallayarak inkübatör plaka transfer ve% 5 CO2 atmosferi ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör bozmadan koloni adet tohum gecede izin. </li></ol> 4. Nikotinamid ile Tanımlı Kültür Sistem altında hESC Kardiyak İndüksiyon <ol><li> Tohumlama sonra 3. günde, plakanın her kuyudan en eski medya kaldırmak ve hESC koloniler (hESC dışarı kuru asla izin) sokulmasına izin verecek kadar medya bırakın. 20 ng / ml bFGF ve 10 mM nikotinamid (NAM) içeren 4 / ml taze hESC medya ile değiştirin. </li><li> 20 ng / ml bFGF ve 10 mM NAM her gün taze hESC içeren medya eski medya değiştirin ve kalp-kaynaklı hESC koloniler gün 8-10 büyümesine olanak. NAM maruz üzerine, koloninin içindeki tüm hücreleri çoğalmaya devam edecek büyük bir farklılaşmış hücre morfoloji değişiklikleri uğrayacaktır. Koloniler, boyutu ve günde 8-10 oranında artacakd hücreleri bazı alanlarda koloniler yığmak başlayacak. </li></ol> 5. Süspansiyon Kültürü Sürekli Kardiyak Farklılaşma <ol><li> HESC kültür plakasına diseksiyon sterilize kaput altında mikroskop diseksiyon (ön-sıcak sahne diseksiyon 37 ° C) alın. Koloniler dikkatle anahat ve P2 steril pipet ucu kenarı ile koloni çevreleyen fibroblast tabakası (farklılaşmış hücrelerin koloni göç) kaldırmak veya cam kapiller çekti. </li><li> Aspire kayan müstakil fibroblast hücreleri içeren eski medya çıkarın. Bir kez hESC medya (bFGF olmadan) ile yıkayın. 3 ml / iyi taze hESC medya (bFGF olmadan) ekleyin. </li><li> Kalp-kaynaklı hESC koloniler küçük parçalar halinde kesin, ve steril pipet veya kapiller çekti cam ile ayırmak. </li><li> 50 ml konik boru birlikte müstakil koloni parçaları içeren medya Havuzu. Plaka birlikte 1 ml / iyi hESC medya (bFGF olmadan) ve yüzme havuzu ile bir kez yıkayın. </li><li> Kısım 4 ml / 37 6-kuyu, ultra eklenti plaka ve inkübe koloni adet içeren serum serbest hESC medya ° C inkübatör yüzen hücre kümeleri (cardioblasts), 4-5 gün için form izin nemlendirilmelidir. </li></ol> 6. Yapıştırıcı Kültür kardiyomiyosit Fenotip Olgunlaşma Dayak <ol><li> 50 ml konik bir tüp içinde yüzen cardioblasts bir arada içeren medya Havuzu. 1400 devirde 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Mümkün olduğu kadar çok eski medya aspire ve 10 mM NAM içeren taze hESC kalp farklılaşma medya eşit miktarda ekleyebilirsiniz. </li><li> 4 ml / 6 kuyucuğu kayan cardioblasts ve kısım karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. 37 plakalar transfer ° C nemlendirilmiş inkübatör cardioblasts gecede takmak için izin verecek. </li><li> HESC kalp farklılaşma medya içeren 10 mM NAM her gün değiştirin. </li><li> 8 gün, NAM olmadan hESC kalp farklılaşma medya ile değiştirin ve hESC kalp farklılaşma medya e değiştirmeye devam ediyorçok başka bir gün. Dayak kardiyomiyositlerde NAM çekilmesinden sonra sürekli ekiminin yaklaşık 1-2 hafta içinde görünür ve zamanla sayıları artış başlayacak ve 3 ay boyunca güçlü ve ritmik kasılmaları korumak olabilir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Nikotinamid (NAM), özel bir cardiomesodermal fenotip (Şekil 2B) pluripotency geçiş için belirlenen kültür sistemi muhafaza hESC neden için yeterli oluşturulur . NAM için farklılaşmamış hESC maruz kalması üzerine, koloninin içindeki tüm hücreleri Ekim-4 ifadesi aşağı düzenler ve kalp spesifik transkripsiyon faktörü (Csx) Nkx2.5 ve α-ifade etmeye başlayacak bu büyük farklılaşmış hücre morfoloji değişiklikleri uğrayacaktır aktinin, bir cardiomesoderm fenotip (Şekil 2B) ile uyumlu. Bu farklılaşmış hücreler çoğalmaya devam edecek ve koloniler boyutu artırmak. Nkx2.5, Artan yoğunluğugenellikle hücreler (Şekil 2B) yığmak başlayan koloniler alanlarda gözlenebilir. Müstakil sonra, NAM-tedavi hESC kalp farklılaşma sürecine devam etmek için bir süspansiyon kültürü yüzen hücre kümeleri (cardioblasts) oluşturacaktır. Cardioblasts takmak için izin ve NAM ile 1 hafta boyunca tedavi devam ettikten sonra, dayak kardiyomiyositlerde kendiliğinden çok-dizi farklılaşma ile karşılaştırıldığında ciddi bir verimlilik artışı ile NAM çekilmesinden sonra sürekli ekiminin yaklaşık 1-2 hafta içinde görünmeye başlayacaktır aynı zaman diliminde (Şekil 2C) üzerinden tedavi olmadan hESC. Dayak kardiyomiyosit kümeler içinde hücreler, Nkx2.5 ve α-aktinin (Şekil 2C) de dahil olmak üzere kardiyomiyositlerinin karakteristik belirteçleri , ifade edecektir. Dayak kardiyomiyositlerde kasılmaları p anımsatan düzenli dürtüleri ile, güçlü, ritmik, iyi koordine edilmiş ve iyi sürüklenen elektrik profilleri tarafından teyit edildi-QRS-T-kompleksleri klinik elektrokardiyogram vücut yüzey elektrotları (Şekil 2C, aynı zamanda Video bakınız) . Kardiyomiyositlerde 3 ay boyunca güçlü kontraktilite elinde tutabilirdi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Özel fonksiyonel hücrelerine karşı insan pluripotent kök hücreleri farklılaşma için küçük molekül-indüksiyon yaklaşımı karşısında geleneksel yaklaşım, genel şemaları. (A) spontan germ tabakası farklılaşma ile insan pluripotent kök hücreleri çok soyundan eğim kullanılarak geleneksel yaklaşım şematik. (B) insan pluripotent kök hücrelerin sadece küçük moleküllerin basit bir hükmün belirli bir klinik ile ilgili soy iyi kontrollü verimli indüksiyon şematik . <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Nikotinamid ve kardiyomiyositlerde yenerek doğru ilerlemesi tanımlanmış koşullar altında pluripotency doğrudan kalp soy özellikleri neden olur. (A) hESC yönlendirilmiş kalp farklılaşma protokol zaman çizgisi resmeden şematik. (B) farklılaşmamış hESC tanımlanan kültür sistemi altında Nikotinamid (NAM) maruz kalma üzerine büyük farklılaştırılmış Eki-4 koloni içinde (kırmızı) negatif hücrelerin kontrol mock-tedavi (DMSO) hESC göre ortaya çıkmaya başladı. NAM-uyarılan Ekim-4-negatif hücrelerin erken kalp farklılaşma ile tutarlı ifade Nkx2.5 (yeşil) ve α-aktinin (kırmızı), başladı. Nkx2.5, aşamalı artan yoğunluğu, genellikle hücrelerin yığmak başladı koloninin alanlarda gözlendi. Tüm hücreler kendi çekirdeğinin DAPI boyama (mavi) ile gösterilir. (C) NAM bağlı kalp-taahhüt hESC hücre clus tarafından değerlendirilir, verimlilikte ciddi bir artış ile yenerek kardiyomiyositlerde verdiritmik kasılmalar (bkz. elektrofizyolojik profili ve Videolar) ve Nkx2.5 (yeşil) ve α-aktinin (kırmızı) immünopozitif görüntülenir ters. Kalp kasları sözleşme temsilcisi temsilcisi büyük dayak kardiyomiyosit kümeleri ve yüksek güç görüntüler Faz görüntüleri (ilgili videoları görmek) gösterilmiştir. Oklar elektrofizyolojik kayıt için kullanılan büyük bir dayak kardiyomiyosit küme gösterir. Elektrofizyolojik profil atan kardiyomiyositlerde klinik elektrokardiyogram görülen p-QRS-T-kompleksleri anımsatan Düzenli, sürüklenen, ritmik dürtülerini gösterir. Ölçek çubuklar: 0.1 mm. Videolar: NAM-indüklenen hESC ayırt kardiyomiyositlerde Akit. Videolar 1 ve 2 gösterisi temsilcisi büyük eklenti sonra 1 ve 3 ay içinde kardiyomiyosit kümeleri yenerek Video 3 ve 4 göstermek temsilcisi yüksek güçte kalp kaslarının sözleşme Video 5 typica gösterirl küçük dayak kardiyomiyosit küme kendiliğinden kontrol olarak NAM tedavi olmadan hESC ayırt. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Video 1 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Video 2 izlemek için buraya tıklayın.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Video 3 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Video 4 izlemek için tıklayınız.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Video 5 izlemek için buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+tissue+engineering%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue.+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li>
<li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li>
<li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li>
<li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li>
<li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li>
<li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li>
<li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li>
<li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li>
<li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+transcription+factor+Csx%2FNkx2-5%3A+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li>
<li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li>
<li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li>
<li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li>
<li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li>
<li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li>
<li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, çatışan çıkarlar beyan ederim. XHP Xcelthera kurucusu. XHP ve EYS hESC ile ilgili fikri mülkiyet var.

Gelişimsel çalışma ve klinik çeviri için en büyük zorluklardan biri, verimli ve öngörülebilir bir insan pluripotent kök hücrelerinin istenen bir fenotip geniş bir farklılaşma potansiyeli nasıl kanal olmuştur. Bu hücrelerde, bir multi-dizi toplama aşamasında giderek tüm germ hücrelerine in vitro kendiliğinden ayırt rağmen hESC elde edilen sadece çok soyundan agrega (embriyoid organları), hücreler çok küçük bir fraksiyonu (&lt;% 2) kendiliğinden kardiyomiyositlerde 13-15 (Şekil 1A) farklılaşırlar. Aşağıdaki immunoselection kardiyomiyositlerinin zenginleştirilmiş popülasyonları hayvan modellerinde 13 kalp içine enjeksiyonunu takiben, mekanik ve elektronik hasarlı miyokard fonksiyonu kurtarmak için biyolojik kalp pili olarak çalışması için başardık . Kemirgen enfarkte modelleri, engrafted hESC elde edilen kardiyak yavrularıyla hayatta ve 12 hafta kadar olgun ve kısmen remuscularyaralı kalp kasılma fonksiyonu 14,15 ize ve geliştirmek. Ancak, çok soyundan pluripotent hücreler farklılaşma ve Tümör Gelişimi aşağıdaki nakli yüksek risk ile insan kalp-taahhüt hücreleri üreten verimsizlik, ileri klinik çeviri engellemiştir. Sadece kalp fenotip ve öngörülebilir pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyeli kanal stratejileri geliştirme harnessing kalp alanında hESC biyoloji güç için hayati önem taşımaktadır. Belirli bir soydan insan pluripotent kök hücrelerinin düzgün bir dönüşüm elde etmek için, biz, sadece klinik olarak ilgili soy belirli bir pluripotent hESC iyi kontrollü verimli indüksiyonu için koşulları tanımlamak için farklılaşmamış hESC yayılması sigortalanması yeteneğine tanımlanmış bir kültür sistemi istihdam küçük moleküllerin basit bir hüküm (Şekil 1B) . Biz doğrudan p o nikotinamid bağlı kalp-dizi taahhüdüdaha yüksek verimlilik (Şekil 2) kardiyomiyositlerde yenerek ilerledikçe belirlenen kültür altında luripotent hESC. Nkx2.5 insan konjenital kalp hastalığı (KKH), en yaygın insan doğuştan gelen bir kusur 16 ile ilişkili olan genin normal kalp gelişimi ve mutasyonlar için vazgeçilmez bir evolutionally korunmuş homeobox transkripsiyon faktörü. Şimdiye kadar incelenen tüm omurgalıların İfadesi Nkx2.5 kalp habercisi hücreler için erken işaretleyici ve uygun kalp septasyon ve oluşumu / elektrik iletim sisteminin 16 olgunlaşması için gereklidir. Omurgalılarda, erken Nkx2.5 ifade başlangıçlı ve desen kabaca erken embriyogenez kalp şartname zamanlaması ve alanı ile örtüşmektedir ve Nkx2.5 gen kalp 16 geliştirilmesi yoluyla ifade edilmesi devam eder. HESC modeli, NAM, kalp-özel transcri ifade teşvik ederek pluripotent hESC doğrudan kalp indüksiyon tetiklemek için ortaya çıktıption faktör Nkx2.5 insan embriyonik cardiogenesis pluripotent epiblast cardiomesoderm özellikleri taklit edebilecek bir süreç. Gelecek çalışmalar, alternatif olarak rejeneratif tedaviler için klinik ile ilgili soy kaynaklanan küçük molekül aracılı hESC pluripotent kaderini doğrudan kontrolü ve modülasyon için önünü hangi insan kalp gelişiminde genetik ve epigenetik kontrol moleküller ortaya koyacaktır. NAM tedaviye gerek kalmadan, &lt;% 2 hESC kardiyomiyositlerde 12-15 yenerek kendiliğinden farklılaşma uğrayacaktır. NAM tedavi ile, insan embriyonik kalp gelişimi 12 taklit edebilecek bir süreç tanımlamak kültürün etkisi altında muhafaza hESC&gt;% 95&gt;% 50 embriyonik kalp öncüleri ve dayak kardiyomiyositlerde oluşturmak mümkün olmuştur. Son zamanlarda, bilinen kalp-kaderini belirleyen genlerin &lt;0.5% 17, 18 gibi düşük bir verimlilik ile doğum sonrası dayak kardiyomiyositlerde içine fare fibroblastlar transdifferentiate kullanılmıştır &lt;/&gt; Destek. Ancak, reprogrammed somatik hücre tarihsel anormal gen ekspresyonu ve engelli terapötik yarar 19-21 ile hızlandırılmış yaşlanması ile ilişkili olmuştur. Son olarak, burada kurulan protokol, iç hücre kütlesinden (ICM) veya 4,5 insan blastosist epiblast elde edilen pluripotent hESC sınırlıdır önceki morula elde edilen hayvansal kaynaklı EKH, EKH dahil olmak üzere diğer pluripotent hücreler için geçerli olmayabilir (sekiz-cell)-dönem embriyoların 22, ve yapay reprogrammed hücreler 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Biyobilim BD </td><td> 356231 </td><td> Düşük büyüme faktörü </td></tr><tr><td> İnsan laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nikotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out serum değiştirme </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM gerekli olmayan amino asit solüsyonu (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM amino asitler çözümü (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Insan insülini </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan aktivin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Tanımlı FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-sıra, ultra eklenti plaka </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-plaka </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

küçük molekül İndüksiyon pluripotent İnsan embriyonik kök hücreleri İnsan kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde verimli türetilmesi

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Bugüne kadar, uygun bir insan kalp hücresi kaynağı eksikliği, ya da hücre tabanlı nakli veya kalp doku mühendisliği 1-3, yenileyici insan miyokardın en büyük gerileme olmuştur . Kardiyomiyositlerde doğumdan kısa süre sonra ölümcül diferansiye olur ve tomurcuklanmaya yeteneğini kaybeder. , Kemik iliği veya kordon kanı diğer kaynaklardan elde edilen kök / progenitör hücreler, kalp içine 1-3 nakli sonrası kontraktil kalp kası hücreleri yol açmaları mümkün olduğunu, hiçbir kanıt yoktur. Hasar gören kalp kası yeniden veya onarım ihtiyacı, yetişkin kök hücre tedavisi, ya endojen veya 1-3 hücre teslim yoluyla karşılanmaktadır olmamıştır . Genetik istikrarlı bir insan embriyonik kök hücreleri (hESC) pluripotent, ihtiyaç soy sınırlı olan insan somatik hücre büyük malzemeleri, in vitro türetme için bir rezervuar proffering, sınırsız genişleme yeteneği ve sınırsız plastisiteonarım ve yenilenme 4,5. Donör organların sıkıntısı, dünya çapında ve akut kardiyovasküler hastalık yaygınlığı nedeniyle, alternatif bir yaklaşım olarak gelişmekte olan hESC tabanlı tedaviler yoğun ilgi var. Ancak, istenen bir fenotip pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyelinin verimli ve öngörülebilir bir kanal nasıl gelişim çalışma ve klinik çeviri için önemli bir sorun olmuştur. Geleneksel yaklaşımlar genellikle fenotipik heterojenite ve istikrarsızlık, dolayısıyla Tümör Gelişimi 6-8 riski yüksek (bkz. şematik bir takip verimsiz ve kontrol edilemeyen bir soy-taahhüt, pluripotent hücrelerin spontan germ tabakası farklılaşma ile çok soyundan eğim güveniyor Şekil 1A). Buna ek olarak, tanımsız / yabancı hayvan biyolojik takviyeleri ve / veya izolasyon, genişlemesi ve hESC farklılaşma için genellikle kullanılan besleyiciler doğrudan kullanımı gibi hücre-speciali yapabilir9-11 sorunlu hastalarda zed greft. Bu engellerin üstesinden gelebilmek için, biz de novo klinik uygun hESC türetme için bir platform olarak hizmet hESC epiblast pluripotence sürdürülmesi için gerekli ve yeterli tanımlanmış bir kültür sistemi unsurlarının çözülmesi ve etkili bir klinik ile ilgili soy doğru düzgün gibi hESC yönetmenlik var küçük moleküller tarafından 12 (Şekil şematik bir bakın. 1B). Küçük moleküller ve büyüme faktörleri çok çeşitli tarama sonra, söz konusu tanımlanmış koşullar nikotinamid (NAM) (Şekil 2, daha yüksek verimlilik ile üretilen insan yenerek kardiyomiyositlerde cardioblasts ilerledi pluripotent hESC doğrudan cardiomesoderm özellikleri ikna etmek için yeterli hale bulundu .) Biz bir iyi-kontrollü verimli türetme sağlayan, bir çok soyundan embriyoid vücut sahne olmadan doğrudan cardioblasts pluripotent hESC indüksiyonu için koşullar tanımlananhücre tabanlı tedavi için gelişim evreleri yelpazesinde insan kalp hücrelerinin büyük kaynağı.

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Günümüze kadar, uygun bir insan kardiyak hücre kaynağının eksikliği, ister hücre bazlı... yoluyla olsun, insan miyokardiyumunun rejenerasyonundaki temel engel olmuştur.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, küçük molekül indüksiyonu kullanarak pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden doğrudan ve münhasıran kardiyak progenitörler elde etmektir. Bu işlem, tanımlı koşullar altında tutulan diferansiye olmamış insan ES hücrelerine nikotinamid eklenerek gerçekleştirilir. Ardından, süspansiyon kültüründe yüzen hücresel kümeler olan kardiyoblastlar oluşturmak için kardiyak diferansiyasyon geçiren hücreler ayrıştırılır.Kardiyoblastlar oluştuktan sonra, atan kardiyomiyositlere dönüşmeye devam ettikleri kardiyak farklılaşma ortamına aktarılırlar. Sonuçlar nihai olarak, dekonvolüsyon veya konfokal mikroskopi ile immünofloresan analizler ve elektrofizyolojik kayıtlar aracılığıyla değerlendirilir. Bu tekniğin temel avantajı, sadece küçük moleküller sağlanarak plüripoten insan embriyonik kök hücrelerinin seçici olarak kardiyak soyuna etkili bir şekilde indüklenmesine olanak tanımasıdır.Mevcut çoklu soy farklılaşma yöntemlerinde hücrelerin yalnızca küçük bir kısmı kardiyak fenotip sergilerken, stok çözeltileri hazırlarken dikkat edilmesi gereken birkaç adım bulunmaktadır. Matrigel ve insan lamininin -80 °C'den 4 °C'ye gece boyunca yavaşça çözünmesine özen gösterin; besiyerini 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce besiyerini her zaman 37 °C'ye ısıtın.Ayrıca, insan ES hücresi medyası hazırlanırken, bazı supplementler kullanımın hemen öncesinde eklenir. Bunlar bFGF, askorbik asit, aktif insan insülini ve transferindir. Ardından, plaka kaplamadan hemen önce Matrigel veya insan laminin çalışma çözeltilerini hazırlayın.Jelatin ile ön kaplanmış doku kültürü plakaları hazırlandıktan sonra, plakaları 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Jelatin yerine matrigel veya laminin çalışma çözeltisi kullanılabilir. Bu plakaları, dört °C'de gece boyunca inkübe ederek kaplayın.İnsan ES hücre kolonilerinin beş ila yedi gün boyunca büyümesine izin vererek başlayın ve ardından bunlardan bazılarını bölmeye hazırlanın. %75'ten fazla diferansiyel olmayan insan ES hücresi içeren kolonileri seçin. Bunlar genellikle tanımlı kenarları olan, hafif opak ve üst üste binmiş hücreler içeren kolonilerdir. Diferansiyasyonun başladığının bir göstergesi olarak ortaya çıkan beyaz koloniler genellikle çoğunlukla diferansiye olmuş hücreler içerir ve genellikle şeffaf görünürler.Beyaz veya şeffaf kolonileri seçmeyin. Plakaları ışığa tutun ve bir markör kullanarak plakaların tabanındaki hafif opak kolonilerin çevresini belirleyin. İnsan ES hücre kolonisini çevreleyen fibroblast tabakasını ayırmak için steril bir P2 pipet ucunun kenarını kullanın.Ardından çevredeki fibroblast hücrelerini ve koloninin tüm diferansiye olmuş kısımlarını uzaklaştırın. Şimdi ayrılmış diferansiye hücreleri içeren eski medyumu aspire ederek çekin. Sonrasında her kuyucuktaki diferansiye olmamış hücreleri, BFGF içermeyen insan ES hücresi medyumu ile bir kez yıkayın ve ardından üç mililitre taze insan ES hücresi medyumu ekleyin; B-F-G-F, taze medyuma kullanımdan hemen önce eklenmelidir.Şimdi, kolonileri küçük parçalara bölmek ve plakadan ayırmak için steril bir P2 pipet ucu kullanın. Ayrılan koloni parçalarını beraberindeki ortamlarıyla birlikte 50 ml'lik konik bir tüpe çekin. Her kuyucuk için ek olarak 1 ml ortam ile durulama yapın.Hücreler artık küçük moleküller kullanılarak gerçekleştirilecek ileri farklılaşma aşaması için hazırdır. İşleme, yeni kaplanmış plakaları 37 °C'ye ısıtarak başlayın. Plakalardaki kaplama solüsyonunu aspire edin ve her bir kuyucuğa koloni parçaları içeren dört mL besiyeri alikotu ekleyin; ardından plakaları sarsmadan nazikçe bir inkübatöre aktarın.Hücrelerin ekilmesine izin vermek için plakaları rahatsız etmeyin. Ardından, hücrelerin sıvı altında kalmasını sağlayacak kadar besiyeri bırakarak eski besiyerinin çoğunu uzaklaştırın. Hücrelerin kurumasına asla izin verilmemelidir.Temel FGF ve nikotinamid içeren taze insan ESL besiyerini karıştırın ve her kuyucuğa bu besiyerinden belirtilen mililitre miktarını ekleyin. Besiyeri, dört degrees Celsius sıcaklıkta iki haftaya kadar saklanabilir ve bu süre boyunca kolonilerin büyümesi için hücre kültürü gün aşırı yenilemek amacıyla kullanılabilir. Sekiz ila 10 gün sonra hücreler, çoğalmış ve üst üste yığılmış büyük diferansiye hücrelere dönüşecek şekilde morfolojik değişiklikler gösterecektir.Ardından, bir süspansiyon kültürü oluşturmak için süspansiyon kültürüne geçin; süspansiyon kültürüne, kendiliğinden farklılaşmış ve bir fibroblast tabakası oluşturmak için dışarı göç etmiş hücrelerden ESL kolonilerini ayırarak başlayın. Yukarıda bahsedilen tekniği steril bir pipet ucuyla uygulayın, ardından yüzen ayrılmış fibroblast hücrelerini içeren eski medyumu aspire ederek uzaklaştırın. Hücreleri bir kez HESC medyumu ile yıkayın ve şimdi steril bir P2 pipet ucu kullanarak onları üç mililitre HESC medyumu içinde yeniden süspande edin.Kolonileri küçük parçalara bölün ve plakadan ayırın. Ayrılmış kolonilerin bulunduğu medyumu tek bir 50 millilitre konik tüpe çekin. Kuyucukları bir millilitre medyum ile durulayın ve durulama sıvısını havuza ekleyin.Ardından, havuzlanmış hücrelerden her bir kuyucuğa dört mililitre olacak şekilde altı kuyucuklu ultra düşük yapışma plakasına paylaştırın ve dört ila beş gün bekletin. Yüzen hücresel kümelerin veya kardiyoblastların oluşmasına ve kardiyoblastların atan kardiyomiyosit fenotipine ilerlemesine izin vermek için plakayı bir inkübatörde tutun. Bunları ortamlarıyla birlikte 50 mililitrelik konik bir tüpte bir araya getirin.Ardından hücreleri 1.400 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Aspirasyon yapın, eski medyumun mümkün olduğu kadarını tartın ve buna eşit miktarda 10 millimolar nikotinamid içeren taze kardiyak diferansiyasyon medyumu ekleyin.Yüzen kardiyo blastlarını pipetleme yoluyla karıştırın, ardından kardiyo blastları süspansiyonundan dört mililitreyi altı kuyucuklu doku kültürü plakalarının her bir kuyucuğuna paylaştırın. Kardiyo blastlarının doku kültürü plakalarına gece boyunca tutunmasını sağlamak için plakaları 37 °C'lik nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. Kültür süresince gün aşırı tekrarlayın.Sekizinci günde, 10 mini molin nikotinamid içeren kardiyak farklılaşma ortamını değiştirin. Nikotinamid içermeyen kardiyak farklılaşma ortamına geçiş yapın. Besiyerini iki günde bir değiştirmeye devam edin.Nikotinamid geri çekildikten sonraki iki hafta içinde, atan kardiyomiyositler görülmeye başlayacak ve sayıları artacaktır; nikotinamid, tanımlanmış kültür sisteminde tutulan insan ES hücrelerinin plüripotentlikten münhasıran kardiyomezodermal bir fenotipe geçişini indüklemek için yeterli hale gelir. Diferansiye olmamış insan ES hücrelerinin nikotinamide maruz kalmasıyla, koloni içindeki tüm hücreler, OCT four ekspresyonunu azaltan büyük diferansiye hücrelere doğru morfolojik değişiklikler göstermiştir. Hücreler ayrıca, kalbe özgü transkripsiyon faktörü NK X 2.5'i ve alfa aktinini eksprese etmeye başlamıştır.Her iki özellik de kardiyo mezoderm fenotipi ile uyumludur. Bu farklılaşmış hücreler, kolonilerin hücrelerin üst üste yığıldığı bölgelerinde çoğalmaya ve boyutca büyümeye devam eder. NKX 2.5 ekspresyonu daha yoğun hale gelmiştir. Ayrılmadan sonra, nikotinamid ile işlem görmüş insan ES hücreleri, süspansiyon kültüründe kardiyoblastlar oluşturmuştur.Kardiyoblastların yapışmasına izin verildikten sonra, kardiyoblastlar bir hafta boyunca nikotinamid ile işleme tabi tutulmuştur; nikotinamidin geri çekilmesinden bir ila iki hafta sonra, verimlilikte belirgin bir artışla birlikte atan kardiyomiyositler görülmeye başlamıştır. Bunlar, ritmik kasılmalarla nabız gibi atan hücresel kümeler şeklinde ortaya çıkmıştır; IDE işlemi görmeyen hücrelerin spontan çoklu soy farklılaşması bu özellikleri göstermemiştir. Atan kardiyomiyosit kümeleri içindeki hücreler, NK X 2.5 ve alfa aktinin dahil olmak üzere kardiyomiyositlere özgü belirteçleri eksprese etmiştir.Atan kardiyomiyositlerin kasılmalarının güçlü, ritmik, koordineli ve iyi senkronize olduğu elektriksel profillerle doğrulanmıştır; bu hücreler, klinik elektrokardiyogramlarda vücut yüzeyi elektrotları ile görülen P-Q-R-S-T komplekslerini anımsatan düzenli impulslar sergilemişlerdir. Ayrıca, kardiyomiyositler, yöntem uzmanlıkla uygulandıktan sonra güçlü kontraktilitelerini üç aydan fazla süreyle koruyabilmişlerdir. Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında, pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden yaklaşık beş hafta içinde homojen bir şekilde kardiyak öncüllerin ve atan kardiyomiyositlerin üretilmesinde kullanılabilir.

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Burada, kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması amacıyla saflaştırılmış kardiyomiyositlerin üretimini sağlayan, küçük molekül modülasyonlu kardiyak farklılaşma ve glikoz yoksunluğu aracılı kardiyomiyosit saflaştırmasını birleştiren insan kardiyomiyosit türevi için sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Pluripotent kök hücrelerden in vitro kardiyomiyositlerin üretilmesi, temel bilim ve klinik uygulamalar için in vitro olarak büyük miktarlarda kalp dokusuna erişim sağlar.  Bu protokol, hem elde edilen kardiyomiyositlerin sayısını artırmak hem de atriyal fenotipli kardiyomiyositler oluşturmak için atriyalize edici faktör Grem2'yi kullanır.

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

Burada, insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) için sağlam, hızlı ve ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu büyük ölçekli yöntem kullanılarak türetilen kardiyomiyositler, insan kardiyovasküler hastalık modellemesinde, yüksek verimli ilaç taramasında ve potansiyel olarak klinik uygulamalarda etkili kullanımları için yeterli hücre sayısı sağlayabilir.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Burada ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücre üretmek için aktivin A ve lentivirus-aracılı ID1-overexpression, basit bir birleşimini kullanarak ölçeklenebilir bir yöntem açıklanmaktadır.

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Burada, yüksek verimli, çok boyutlu bir formatta kültürlenmiş, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden kardiyak sferoidlerin (CSs) üretilmesi ve kriyoprezervasyonu için bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu üç boyutlu model, hastalık modellemesi, yüksek verimli taramalar için sağlam bir platform olarak işlev görür ve kriyoprezervasyondan sonra işlevselliğini korur.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyak Sferoidlerin Üretimi, Yüksek Verimli Taraması ve Biyobankacılığı

Keşfedin küçük molekül indüksiyonu kullanarak pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak öncüler ve fonksiyonel kardiyomiyositler üretme yöntemini. Bu teknik kardiyovasküler onarım için yüksek verimli hücre sağlar.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi (Video) | JoVE Journal

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Daha fazla video keşfet