Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, küçük molekül indüksiyonu kullanarak pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden doğrudan ve münhasıran kardiyak progenitörler elde etmektir. Bu işlem, tanımlı koşullar altında tutulan diferansiye olmamış insan ES hücrelerine nikotinamid eklenerek gerçekleştirilir. Ardından, süspansiyon kültüründe yüzen hücresel kümeler olan kardiyoblastlar oluşturmak için kardiyak diferansiyasyon geçiren hücreler ayrıştırılır.

Kardiyoblastlar oluştuktan sonra, atan kardiyomiyositlere dönüşmeye devam ettikleri kardiyak farklılaşma ortamına aktarılırlar. Sonuçlar nihai olarak, dekonvolüsyon veya konfokal mikroskopi ile immünofloresan analizler ve elektrofizyolojik kayıtlar aracılığıyla değerlendirilir. Bu tekniğin temel avantajı, sadece küçük moleküller sağlanarak plüripoten insan embriyonik kök hücrelerinin seçici olarak kardiyak soyuna etkili bir şekilde indüklenmesine olanak tanımasıdır.

Mevcut çoklu soy farklılaşma yöntemlerinde hücrelerin yalnızca küçük bir kısmı kardiyak fenotip sergilerken, stok çözeltileri hazırlarken dikkat edilmesi gereken birkaç adım bulunmaktadır. Matrigel ve insan lamininin -80 °C'den 4 °C'ye gece boyunca yavaşça çözünmesine özen gösterin; besiyerini 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce besiyerini her zaman 37 °C'ye ısıtın.

Ayrıca, insan ES hücresi medyası hazırlanırken, bazı supplementler kullanımın hemen öncesinde eklenir. Bunlar bFGF, askorbik asit, aktif insan insülini ve transferindir. Ardından, plaka kaplamadan hemen önce Matrigel veya insan laminin çalışma çözeltilerini hazırlayın.

Jelatin ile ön kaplanmış doku kültürü plakaları hazırlandıktan sonra, plakaları 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Jelatin yerine matrigel veya laminin çalışma çözeltisi kullanılabilir. Bu plakaları, dört °C'de gece boyunca inkübe ederek kaplayın.

İnsan ES hücre kolonilerinin beş ila yedi gün boyunca büyümesine izin vererek başlayın ve ardından bunlardan bazılarını bölmeye hazırlanın. %75'ten fazla diferansiyel olmayan insan ES hücresi içeren kolonileri seçin. Bunlar genellikle tanımlı kenarları olan, hafif opak ve üst üste binmiş hücreler içeren kolonilerdir. Diferansiyasyonun başladığının bir göstergesi olarak ortaya çıkan beyaz koloniler genellikle çoğunlukla diferansiye olmuş hücreler içerir ve genellikle şeffaf görünürler.

Beyaz veya şeffaf kolonileri seçmeyin. Plakaları ışığa tutun ve bir markör kullanarak plakaların tabanındaki hafif opak kolonilerin çevresini belirleyin. İnsan ES hücre kolonisini çevreleyen fibroblast tabakasını ayırmak için steril bir P2 pipet ucunun kenarını kullanın.

Ardından çevredeki fibroblast hücrelerini ve koloninin tüm diferansiye olmuş kısımlarını uzaklaştırın. Şimdi ayrılmış diferansiye hücreleri içeren eski medyumu aspire ederek çekin. Sonrasında her kuyucuktaki diferansiye olmamış hücreleri, BFGF içermeyen insan ES hücresi medyumu ile bir kez yıkayın ve ardından üç mililitre taze insan ES hücresi medyumu ekleyin; B-F-G-F, taze medyuma kullanımdan hemen önce eklenmelidir.

Şimdi, kolonileri küçük parçalara bölmek ve plakadan ayırmak için steril bir P2 pipet ucu kullanın. Ayrılan koloni parçalarını beraberindeki ortamlarıyla birlikte 50 ml'lik konik bir tüpe çekin. Her kuyucuk için ek olarak 1 ml ortam ile durulama yapın.

Hücreler artık küçük moleküller kullanılarak gerçekleştirilecek ileri farklılaşma aşaması için hazırdır. İşleme, yeni kaplanmış plakaları 37 °C'ye ısıtarak başlayın. Plakalardaki kaplama solüsyonunu aspire edin ve her bir kuyucuğa koloni parçaları içeren dört mL besiyeri alikotu ekleyin; ardından plakaları sarsmadan nazikçe bir inkübatöre aktarın.

Hücrelerin ekilmesine izin vermek için plakaları rahatsız etmeyin. Ardından, hücrelerin sıvı altında kalmasını sağlayacak kadar besiyeri bırakarak eski besiyerinin çoğunu uzaklaştırın. Hücrelerin kurumasına asla izin verilmemelidir.

Temel FGF ve nikotinamid içeren taze insan ESL besiyerini karıştırın ve her kuyucuğa bu besiyerinden belirtilen mililitre miktarını ekleyin. Besiyeri, dört degrees Celsius sıcaklıkta iki haftaya kadar saklanabilir ve bu süre boyunca kolonilerin büyümesi için hücre kültürü gün aşırı yenilemek amacıyla kullanılabilir. Sekiz ila 10 gün sonra hücreler, çoğalmış ve üst üste yığılmış büyük diferansiye hücrelere dönüşecek şekilde morfolojik değişiklikler gösterecektir.

Ardından, bir süspansiyon kültürü oluşturmak için süspansiyon kültürüne geçin; süspansiyon kültürüne, kendiliğinden farklılaşmış ve bir fibroblast tabakası oluşturmak için dışarı göç etmiş hücrelerden ESL kolonilerini ayırarak başlayın. Yukarıda bahsedilen tekniği steril bir pipet ucuyla uygulayın, ardından yüzen ayrılmış fibroblast hücrelerini içeren eski medyumu aspire ederek uzaklaştırın. Hücreleri bir kez HESC medyumu ile yıkayın ve şimdi steril bir P2 pipet ucu kullanarak onları üç mililitre HESC medyumu içinde yeniden süspande edin.

Kolonileri küçük parçalara bölün ve plakadan ayırın. Ayrılmış kolonilerin bulunduğu medyumu tek bir 50 millilitre konik tüpe çekin. Kuyucukları bir millilitre medyum ile durulayın ve durulama sıvısını havuza ekleyin.

Ardından, havuzlanmış hücrelerden her bir kuyucuğa dört mililitre olacak şekilde altı kuyucuklu ultra düşük yapışma plakasına paylaştırın ve dört ila beş gün bekletin. Yüzen hücresel kümelerin veya kardiyoblastların oluşmasına ve kardiyoblastların atan kardiyomiyosit fenotipine ilerlemesine izin vermek için plakayı bir inkübatörde tutun. Bunları ortamlarıyla birlikte 50 mililitrelik konik bir tüpte bir araya getirin.

Ardından hücreleri 1.400 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Aspirasyon yapın, eski medyumun mümkün olduğu kadarını tartın ve buna eşit miktarda 10 millimolar nikotinamid içeren taze kardiyak diferansiyasyon medyumu ekleyin.

Yüzen kardiyo blastlarını pipetleme yoluyla karıştırın, ardından kardiyo blastları süspansiyonundan dört mililitreyi altı kuyucuklu doku kültürü plakalarının her bir kuyucuğuna paylaştırın. Kardiyo blastlarının doku kültürü plakalarına gece boyunca tutunmasını sağlamak için plakaları 37 °C'lik nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın. Kültür süresince gün aşırı tekrarlayın.

Sekizinci günde, 10 mini molin nikotinamid içeren kardiyak farklılaşma ortamını değiştirin. Nikotinamid içermeyen kardiyak farklılaşma ortamına geçiş yapın. Besiyerini iki günde bir değiştirmeye devam edin.

Nikotinamid geri çekildikten sonraki iki hafta içinde, atan kardiyomiyositler görülmeye başlayacak ve sayıları artacaktır; nikotinamid, tanımlanmış kültür sisteminde tutulan insan ES hücrelerinin plüripotentlikten münhasıran kardiyomezodermal bir fenotipe geçişini indüklemek için yeterli hale gelir. Diferansiye olmamış insan ES hücrelerinin nikotinamide maruz kalmasıyla, koloni içindeki tüm hücreler, OCT four ekspresyonunu azaltan büyük diferansiye hücrelere doğru morfolojik değişiklikler göstermiştir. Hücreler ayrıca, kalbe özgü transkripsiyon faktörü NK X 2.5'i ve alfa aktinini eksprese etmeye başlamıştır.

Her iki özellik de kardiyo mezoderm fenotipi ile uyumludur. Bu farklılaşmış hücreler, kolonilerin hücrelerin üst üste yığıldığı bölgelerinde çoğalmaya ve boyutca büyümeye devam eder. NKX 2.5 ekspresyonu daha yoğun hale gelmiştir. Ayrılmadan sonra, nikotinamid ile işlem görmüş insan ES hücreleri, süspansiyon kültüründe kardiyoblastlar oluşturmuştur.

Kardiyoblastların yapışmasına izin verildikten sonra, kardiyoblastlar bir hafta boyunca nikotinamid ile işleme tabi tutulmuştur; nikotinamidin geri çekilmesinden bir ila iki hafta sonra, verimlilikte belirgin bir artışla birlikte atan kardiyomiyositler görülmeye başlamıştır. Bunlar, ritmik kasılmalarla nabız gibi atan hücresel kümeler şeklinde ortaya çıkmıştır; IDE işlemi görmeyen hücrelerin spontan çoklu soy farklılaşması bu özellikleri göstermemiştir. Atan kardiyomiyosit kümeleri içindeki hücreler, NK X 2.5 ve alfa aktinin dahil olmak üzere kardiyomiyositlere özgü belirteçleri eksprese etmiştir.

Atan kardiyomiyositlerin kasılmalarının güçlü, ritmik, koordineli ve iyi senkronize olduğu elektriksel profillerle doğrulanmıştır; bu hücreler, klinik elektrokardiyogramlarda vücut yüzeyi elektrotları ile görülen P-Q-R-S-T komplekslerini anımsatan düzenli impulslar sergilemişlerdir. Ayrıca, kardiyomiyositler, yöntem uzmanlıkla uygulandıktan sonra güçlü kontraktilitelerini üç aydan fazla süreyle koruyabilmişlerdir. Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında, pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinden yaklaşık beş hafta içinde homojen bir şekilde kardiyak öncüllerin ve atan kardiyomiyositlerin üretilmesinde kullanılabilir.